YIGSR修饰的β-咔啉，其制备，纳米结构，活性和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰 _Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的正规简称是HGSR。涉及它的制备方 法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移 的作用，进一步涉及它的抗炎和抗栓作用。本发明属于生物医药领域。 技术背景
[0002] 恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤 并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90%以上的恶性肿瘤患者都是 死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞 噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血 管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织；4)炎症使进入正常组织的肿瘤细胞成 长为转移的新生肿瘤。
[0003] 由于现有抗肿瘤药物不具备抗炎症、抗血栓和抗转移作用，所以疗效不理想。发明 同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。
[0004] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素ανβ3的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘 附活性。层粘连蛋白-lll(laminin-lll)参与到肿瘤的生长、浸润、转移、粘附和血管生成 等多个生理过程。Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg〇iIGSR)序列位于层连蛋白-111的β1链上，申请 人曾经报道在浓度为1μΜ时它可以抑制肿瘤细胞粘附和浸润。申请人曾经把它们与雌激 素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢-β-咔啉-3-羧 酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢_β-咔啉-3-羧酸、β-咔 啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或 1-位取代的β_咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构 类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具 有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤粘附浸润和迁移作用的化合物。
[0005] 发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将YIGSR与 1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸偶联，形成的化合物1-(4-羟基-3-甲氧 羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg会同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓 和抗肿瘤粘附浸润和迁移作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个内容是提供下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲醜-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。
[0007]
[0008] 本发明的第二个内容是提供1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔啉-3-甲 酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的制备方法，该方法包括：
[0009] (1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90°C反应2h，生成5-甲酰水杨 酸甲酯；
[0010] (2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；
[0011] (3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为 1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0012] (4)在2, 3-二氯-5,6-二腈基-1，4-苯醌（DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧 羰基苯基）-1，2,3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃（THF)中氧化为1-(4-羟 基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0013] (5)在Pd/C和Η2存在下，在甲醇中1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧 酸苄酯反应生成1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸；
[0014] (6)采用标准操作液相逐步缩合法，在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得 到全保护多肽序列Boc-Tyr_Ile-Gly-Ser-Arg(N02)-0Bzl;
[0015] (7)在冰浴下氯化氢的乙酸乙酯溶液（4M)中，Boc-Tyr_Ile-Gly-Ser-Arg(N02)-0 Bzl脱除Boc得到Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(N02)-〇Bzl;
[0016] (8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸在无 水THF中与Tyr-11e-Gly-Ser-Arg(Ν02)-ΟΒζ1缩合为1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲醜-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(N02)-〇Bzl;
[0017] (9)在Pd/C和H2存在下，在甲醇中化合物1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲酰-Tyr_Ile-Gly-Ser-Arg(N02)-0Bzl反应得到化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基 苯基）-β-咔琳-3-甲醜-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg。
[0018] 本发明的第三个内容是测定化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的纳米结构。
[0019] 本发明的第四个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。
[0020] 本发明的第五个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg对荷sl80小鼠肿瘤生长的抑制作用。
[0021] 本发明的第六个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg体外抑制肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移的作用。
[0022] 本发明的第七个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的体内抗炎作用。
[0023] 本发明的第八个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg的抗血小板聚集和抗血栓作用。
【附图说明】
[0024] 图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨 基酸或甘氨酸。
[0025] 图2.化合物5的合成路线·i)CH30H，浓H2S04，微波90°C;ii)多聚磷酸，苯甲醇， 油浴 75°C;iii)CH2Cl2,TFA;iv)THF，DDQ;v)CH30H，Pd/C，H2 ;vi)DCC，HOBt，NMM，THF;vii) CH30H，2NNaOH;viii)氯化氢/乙酸乙酯溶液（4M)。
[0026] 图3.化合物5在纯水溶液中1X10 7M浓度下的透射电镜照片。
[0027] 图4.化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性。
【具体实施方式】
[0028] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0029] 实施例1制备5-甲酰水杨酸甲酯
[0030] 称取1. 660g(10. 0mmol)5_甲酰水杨酸于微波反应罐中，加入25mL甲醇及lmL浓 H2S04，于微波反应器中90°C反应2h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降至室温后， 将反应液转移至lOOmL茄形瓶中，用浓氨水调pH值至7-8,将反应液减压浓缩至干后，加大 量乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯层依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍，然后用无水Na2S04干 燥2h，过滤、减压浓缩至于，于室温放置过夜即有晶体析出，得1.635g(90.8% )目标化合 物，为淡黄色针状晶体。ESI-MS(m/e) :181[M+H]+。
[0031] 实施例2制备L-色氨酸苄酯
[0032] 称取15. 0g(44. 4mmol)多聚磷酸于500mL爺形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油 浴50°C中溶解，待溶液温度上升至75°C后，称取10g(49.Ommol)L-色氨酸加入其中，75°C下 反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后，在冰浴搅拌下往反应瓶中倒入 400mL无水乙醚，此时有白色固体析出，搅拌过夜后将之过滤，白色固体用200mL乙酸乙酯 和10mL水悬浮，用三乙胺调溶液pH值至8左右，溶液变为澄清状，静置分液，将分离的酯层 依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍，乙酸乙酯层用无水Na2S04干燥2h，过滤、减压浓缩 至干，得12.85g(89.2%)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e) :295[M+H] +。
[0033] 实施例3制备1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸 节酯（1)
[0034] 往250mL茄形瓶中加入100mLCH2C12及lOmLTFA，搅拌均匀后称取 11. 76g(40. 0mmol)L-色氨酸节酯和7. 92g(44. 0mmol)5-甲酰水杨酸甲酯加入其中，数分 钟后反应液变为微红色，2天后反应液变为黑色，在冰浴搅拌下缓慢滴加浓氨水将反应液 调pH值至8,将反应液静置分液，将分离CH2C12层依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍， CH2C12层用无水Na2S04干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得14. 59g(80% )目标化合物，为黄色 固体。ESI-MS(m/e) :457[M+H]+。
[0035] 实施例4制备1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸苄酯（2)
[0036] 称取1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2,3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄 酯 4. 56g(10.Ommol)于 250mL茄形瓶中，用干燥THF溶解，加入DDQ4. 54g(20.Ommol)， 数分钟后反应液变浑浊，4h后反应完全，过滤，滤出固体依次用饱和NaHC03、甲醇、乙醚 洗，过滤，得3. 75g(82. 7%)目标化合物，为灰白色固体。ESI-MS(m/e) :453[M+H]+;Mp: 190.4-191.0°C.NMR(300MHz,DMSO) ：δ/ppm= 8. 87(s, 1H), 8. 42 (m, 2H), 8. 10 (dd,J =2. 1Hz,J= 2. 1Hz, 1H) ,7. 69 (d,J= 8. 1Hz, 1H), 7. 57 (m, 3H), 7. 37 (m, 3H), 7. 04 (d,J= 6. 3Hz)，5. 46(s，1H)，3. 88(s，3H). 13CNMR(75MHz，DMS0) :δ/ppm= 169. 28,165. 93,142. 35， 137. 07,135. 13,131. 75,129. 30,128. 98,128. 47,128. 41,122. 40,121. 73,120. 62,116. 54, 114.71,66. 39,52. 47.Elem.Anal：C27H20N205·C, 71. 67 ；H,4. 46 ；N,6. 19〇
[0037] 实