一种基于酪氨酸酶/多酚类介体制备纳米丝素材料的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于酪氨酸酶/多酚类介体制备纳米丝素材料的方法，特别是一种利用酪氨酸酶催化氧化丝素和多酚类介体，促进丝素蛋白与外源功能性氨基化合物结合，制备功能性纳米丝素材料的方法，属于纺织生物技术领域。
【背景技术】
[0002]丝素有良好的生物相容性，以其为原料加工的丝素蛋白膜在组织工程材料构建中有较广泛的用途。天然丝素蛋白材料韧性较差，水溶失率高，为提高再生丝素膜材料的力学性能与功能性，国内外在丝素蛋白及其复合材料改性方面进行了相关研究。其中化学方法应用较多，一般多以戊二醛、多元羧酸等对丝素蛋白进行交联或与外源功能化合物接枝。这类方法在改善丝素材料性能的同时也存在一定不足，包括易产生化学有害物质残留等问题。生物方法具有安全、高效、专一和环境友好等优点，以酶法对丝素蛋白材料进行改性，不但保持了丝素蛋白原有的优良特性，而且赋予丝素蛋白材料新的应用性能，对环境影响也较小，因此具有一定的应用前景。
[0003]生物酶对丝素蛋白材料的改性功效与丝素蛋白结构、酶的选择性等相关。丝素蛋白中疏水性甘氨酸、丙氨酸剩基含量较高，其次为含极性基团的丝氨酸(含羟甲基)和酪氨酸(含酚羟基)残基。酪氨酸酶是具有催化氧化活性的多酚氧化酶，能催化氧化含酚羟基的酪氨酸剩基相继生成邻苯酚和多巴醌，并可进一步与含氨基的功能性化合物反应，为丝素蛋白的功能化改性提供了方法。研究结果表明，由于丝素蛋白中酪氨酸残基分布于由疏水性较强的丙氨酸和甘氨酸组成的大分子链中，对酶促反应的可及度产生了一定影响，因此，基于酪氨酸酶法的丝素蛋白功能化改性效率有待提高。
[0004]多酚类化合物包括茶多酚、咖啡酸、阿魏酸等，这类化合物也具有与酪氨酸相似的酚羟基结构。多酚类化合物也能被酪氨酸酶催化氧化，生成反应性较强的活性醌结构(A)，活性醌分子不但可以相互聚合(A-A-A)，也可以同时与二分子氨基化合物(B)发生反应，形成氨基化合物分子间的交联(B-A-B)。根据这一特性，在酪氨酸酶催化氧化丝素(SF)的反应中，丝素不仅可直接与外源氨基化合物反应，形成两者直接交联(SF-B);还可在体系加入适量多酚类介质体系，在氧化多酚介体生成醌类活性基的基础上，形成以活性醌结构为桥梁的氨基化合物在丝素表面的间接接枝(SF-A-B)，从而提升丝素酶法功能化改性的效率，在此基础上制备出功能性纳米丝素材料。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种基于酪氨酸酶/多酚类介体制备纳米丝素材料的方法，旨在提高酪氨酸酶催化条件下丝素与外源氨基化合物的接枝反应效率，在此基础上制备功能性丝素材料。
[0006]为解决上述技术问题，本发明利用酪氨酸酶催化氧化丝素和多酚类介体，促进丝素蛋白与外源功能性氨基化合物间的交联，结合静电纺丝制备功能性纳米丝素材料的方法，具体工艺与步骤如下:
[0007](I)丝素溶液制备:以溴化锂或氯化钙溶解桑蚕丝，制备丝素溶液；
[0008]处理工艺处方及条件:将桑蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液体系中，在30?80°C溶解后将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析8?36小时后过滤，制得浓度为10?50g/L丝素溶液；
[0009](2)酪氨酸酶/多酚类介体催化丝素与氨基化合物交联:在步骤(I)丝素溶液中加入酪氨酸酶和氨基化合物，反应0.5?8小时后加入多酚类介体，在相同温度条件下继续处理0.5?24小时；
[0010]处理工艺处方及条件:酪氨酸酶I?100U/ml、氨基化合物I?50g/L、多酚类介体I ?10g/L，温度 20 ?60°C，pH 范围 6.0 ?8.0 ;
[0011](3)纳米丝素材料成型:将步骤(2)反应后的丝素溶液，通过延流使其在成型模具内平整铺展，在室温下风干成膜或在_50°C?_20°C条件下冷冻干燥成膜；以98%甲酸进行丝素膜溶解，配制纺丝液，采用静电纺技术纺制纳米丝素材料；
[0012]纺丝工艺及条件:纺丝液中丝素浓度为10?45%，纺丝电压为10?40kV，纺丝速度为0.3?2ml/h，注射器针尖与金属辊筒表面的纺丝间距为5?20cm。
[0013]—种基于酪氨酸酶/多酚类介体制备纳米丝素材料的方法，所述丝素溶液制备时选用溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液；所述酪氨酸酶品种来源于动物、植物或微生物；所述多酚类介体包括儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸和绿原酸；所述氨基化合物包括含有氨基的化学整理剂、功能性多肽、壳聚糖、聚赖氨酸、弹性蛋白和明胶。
[0014]本发明利用酪氨酸酶催化氧化丝素与外源氨基化合物反应，在氧化多酚介体生成醌类活性基的基础上，提升丝素酶法改性的效率，构建功能性纳米丝素材料。与传统化学交联法制备丝素复合膜相比，本发明具有以下优点:
[0015](I)酶催化效率高，利用酪氨酸酶催化丝素和多酚类介体氧化，促进丝素与氨基化合物交联的反应中酶催化效率高，酶制剂用量较少；
[0016](2)酶处理条件缓和，在低温和近中性条件下进行丝素蛋白功能化改性，具有能耗低、处理工艺安全的优点，避免了化学交联法反应易造成环境污染、丝素材料安全性低等诸多方面的缺陷；
[0017](3)纳米丝素材料性能改善明显，基于酪氨酸酶/多酚类介体法改性丝素蛋白，不但制得的丝素纳米材料水溶性低，具有特定的功能性，产品的生物相容性也较好。
【具体实施方式】
[0018]采用酪氨酸酶和多酚类介体催化丝素和外源氨基化合物交联，制备功能性纳米丝素材料，具体实施例如下:
[0019]实施例1
[0020](I)丝素溶液准备:桑蚕丝加入到溴化锂-乙醇-水(质量比45:45:10)溶液中，60°C溶解后将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析24小时，期间每小时换I次水，透析后过滤得到20g/L的丝素水溶液；
[0021](2)在步骤⑴丝素溶液中加入10U/ml酪氨酸酶和5g/L弹性蛋白，在30°C、pH7条件下处理4小时后加入2g/L儿茶素，继续处理12小时；
[0022](3)纳米丝素材料成型:将步骤(3)反应后的丝素溶液在聚四氟乙烯成型模具内平整铺展，室温下风干成膜；以98%甲酸进行丝素膜溶解，配制浓度为15%的丝素纺丝液，采用静电纺技术纺制纳米丝素材料，其中纺丝电压为15kV，纺丝速度为0.6ml/h，注射器针尖与金属辊筒表面的纺丝间距为10cm。
[0023]丝素纳米材料试样1:处理中添加酪氨酸酶、未添加儿茶素；
[0024]丝素纳米材料试样2:处理中添加酪氨酸酶、添加儿茶素；
[0025]经上述工艺处理后，评价NIH/3T3细胞在丝素/弹性蛋白复合膜培养基中浸渍24小时后的存活率，并测定纳米丝素材料的断裂强度和断裂伸长率。结果表明，试样I的NIH/3T3细胞存活率为80%、断裂强度和断裂伸长率分别为2.1MPaU.9% ;试样2的细胞存活率为83%、断裂强度和断裂伸长率能分别达到2.8MPa、2.8%。
[0026]实施例2
[0027](I)丝素溶液准备:桑蚕丝加入到到氯化钙-乙醇-水(摩尔比1: 1:7)，70°C溶解后将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析24小时，期间每小时换I次水，透析后过滤得到18g/L的丝素水溶液；
[0028](2)在步骤(I)丝素溶液中加入8U/ml酪氨酸酶和2g/L壳聚糖，在30°C、pH7条件下处理3小时后加入lg/L咖啡酸，继续处理15小时；
[0029](3)纳米丝素材料成型:将步骤(3)反应后溶液在聚四氟乙烯成型模具内平整铺展，室温下风干成膜；以98%甲酸进行丝素膜溶解，配制浓度为15%的丝素纺丝液，采用静电纺技术纺制纳米丝素材料，其中纺丝电压为20kV，纺丝速度为0.8ml/h，注射器针尖与金属辊筒表面的纺丝间距为12cm。
[0030]丝素纳米材料试样3:处理中未添加酪氨酸酶和咖啡酸；
[0031]丝素纳米材料试样4:处理中添加酪氨酸酶，未添加咖啡酸；
[0032]丝素纳米材料试样5:处理中添加酪氨酸酶和咖啡酸；
[0033]经上述工艺处理后，将试样3、4、5以50%乙醇溶液处理后在30°C水溶液中浸渍6小时，测定丝素膜材料的水溶失率和对金黄色葡萄球菌的抑菌率。其中，试样3的水溶失率为12.2%，抑菌率为85% ;试样4的水溶失率为6.2%，抑菌率为91% ;试样5的水溶失率为4.3%，抑菌率为95%。
[0034]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种基于酪氨酸酶/多酚类介体制备纳米丝素材料的方法，特别是一种利用酪氨酸酶催化氧化丝素和多酚类介体，促进丝素蛋白与外源功能性氨基化合物结合，制备功能性纳米丝素膜材料的方法，具体工艺与步骤如下: (1)丝素溶液制备:以溴化锂或氯化钙溶解桑蚕丝，制备丝素溶液； 处理工艺处方及条件:将桑蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液体系中，在30?80°C溶解后将丝素溶液装入透析袋，以去离子水中透析8?36小时后过滤，制得浓度为10?50g/L丝素溶液； (2)酪氨酸酶/多酚类介体催化丝素与氨基化合物交联:在步骤(I)丝素溶液中加入酪氨酸酶和氨基化合物，反应0.5?8小时后加入多酚类介体，在相同温度条件下继续处理0.5?24小时； 处理工艺处方及条件:酪氨酸酶I?100U/ml、氨基化合物I?50g/L、多酸类介体I?10g/L，温度 20 ?60°C，pH 范围 6.0 ?8.0 ; (3)纳米丝素材料成型:将步骤(2)反应后的丝素溶液，通过延流使其在成型模具内平整铺展，在室温下风干成膜或在_50°C?_20°C条件下冷冻干燥成膜；以98%甲酸进行丝素膜溶解，配制纺丝液，采用静电纺技术纺制纳米丝素材料； 纺丝工艺及条件:纺丝液中丝素浓度为10?45%，纺丝电压为10?40kV，纺丝速度为0.3?2ml/h电压，注射器针尖与金属棍筒表面的纺丝间距为5?20cm。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述丝素溶液制备时选用溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液；所述酪氨酸酶品种来源于动物、植物或微生物；所述多酚类介体包括儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸和绿原酸；所述氨基化合物包括含有氨基的化学整理剂、功能性多肽、壳聚糖、聚赖氨酸、弹性蛋白和明胶。
【专利摘要】本发明公开了一种基于酪氨酸酶/多酚类介体制备纳米丝素材料的方法，利用酪氨酸酶催化氧化丝素中酪氨酸和多酚类介体中酚羟基，生成反应性活性醌结构，促进丝素与外源功能性氨基化合物反应，制备功能性纳米丝素材料。具体步骤如下：(1)丝素溶液制备；(2)以酪氨酸酶催化氧化丝素与氨基化合物交联，反应一段时间后在体系中添加多酚类介体促进反应；(3)纳米丝素材料成型：将丝素与氨基化合物反应后溶液通过延流铺展，经室温风干成膜或冷冻干燥成膜，以甲酸配制纺丝液，采用静电纺技术纺制纳米丝素材料。与传统化学交联法制备功能型丝素材料相比，本发明酶催化效率高，酶处理条件缓和，纳米丝素材料的性能改善明显。
【IPC分类】D04H1/728, D04H1/42, C08J3/24, D01D5/00, D01D1/02
【公开号】CN105088540
【申请号】CN201510621104
【发明人】王平, 洪言情, 崔莉, 王强, 范雪荣
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月25日