具有高效抗氧化抑菌效果的组合物及其应用

1.本发明涉及防腐剂领域，具体涉及一种具有高效抗氧化抑菌效果的组合物及其应用
。


背景技术：

2.从农场到餐桌的整个环节中，食品均易受到微生物的侵染而发生腐败
。
全球每年约有
13.1
亿吨的食物因食品腐败被浪费，约占总生产产出的三分之一
。
化学防腐剂有低毒性和引起细菌耐药性的风险，故寻找安全的天然食品原料作为抑菌抗氧化进而防腐保鲜逐渐成为新趋势
。
3.ε-聚赖氨酸为生物源抑菌成分，抑菌性强，稳定性好
。gb 2760-2014
已允许
ε-聚赖氨酸作为防腐剂应用于焙烤食品
、
熟肉制品
、
果蔬汁及其饮料
。
但由于
ε-聚赖氨酸可能会被蛋白酶降解，其抑菌性在生肉等食物中受到一定限制
。


技术实现要素：

4.本发明基于
ε-聚赖氨酸在生肉等食品中抑菌性受限的问题出发，结合
ε-聚赖氨酸抑菌机制，根据机制互补原理筛选出石榴多酚主要组分安石榴苷进行复配，提供一种具有高效协同抗氧化抑菌效果的组合物及其应用
。
本发明通过棋盘法筛选协同抑菌配方，通过抑菌圈实验和时间杀菌曲线验证配方的协同抑菌效果，最后将组合物应用于食品保鲜
、
抗菌抗氧化剂，抗菌剂和自由基清除剂的制备
。
5.为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
6.本发明提供了一种具有高效抗氧化抑菌效果的组合物，所述组合物包括
ε-聚赖氨酸和石榴多酚
。
7.优选地，所述石榴多酚为安石榴苷，所述组合物包括
ε-聚赖氨酸和安石榴苷；且所述组合物为水溶液，其中，所述组合物中，
ε-聚赖氨酸的浓度为
3.75
～
37.5
μ
g/ml
和安石榴苷的浓度为
0.0469
～
6.25mg/ml。
8.更优选地，所述组合物中，
ε-聚赖氨酸的浓度为
20
～
37.5
μ
g/ml
和安石榴苷的浓度为
0.469
～
4.25mg/ml。
9.最优选地，所述组合物中，
ε-聚赖氨酸的浓度为
37.5
μ
g/ml
和安石榴苷的浓度为
0.469mg/ml。
10.上述具有高效抗氧化抑菌效果的组合物的制备方法是依次
ε-聚赖氨酸和石榴提取物加入水中，搅拌均匀，得到组合物
。
11.本发明还提供了一种上述具有高效抗氧化抑菌效果的组合物在制备抗菌抗氧化剂中的应用
。
12.本发明还提供了一种上述具有高效抗氧化抑菌效果的组合物在制备保鲜剂中的应用
。
13.优选地，所述保鲜剂用于食品保鲜
。
14.更优选地，所述食品为高蛋白食品或多糖基制品
。
15.再进一步地，所述高蛋白食品为熟肉制品
、
生肉或卤肉制品；所述多糖基制品为魔芋豆腐
、
魔芋辣条
、
魔芋软糖
、
魔芋米饭或魔芋面条
。
16.本发明还提供了一种上述具有高效抗氧化抑菌效果的组合物在制备抑制细菌的抑菌剂中的应用
。
17.优选地，所述细菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌
。
18.本发明还提供了一种上述具有高效抗氧化抑菌效果的组合物在制备自由基清除剂中的应用
。
19.优选地，所述自由基为
dpph
自由基或
abts
自由基
。
20.本发明的原理：
21.ε-聚赖氨酸为生物源抑菌成分，抑菌性强，稳定性好
。gb 2760-2014
已允许
ε-聚赖氨酸作为防腐剂应用于焙烤食品
、
熟肉制品
、
果蔬汁及其饮料
。
由于
ε-聚赖氨酸与食品中其他组分间的相互作用影响其抑菌效果，且单一保鲜剂存在抑菌谱有限的问题，多种保鲜剂相结合可以获得更好的保鲜效果
。
安石榴苷
(punicalagin
，
pc)
是石榴果实和果皮中独特的主要多酚成分，在石榴果皮中含量尤其丰富，已经作为食品添加剂
(
稳定剂
、
抑菌剂
)
添加到食品中，且无使用限量，在防腐领域具有良好的抑菌性和抗氧化性
。
22.故将
ε-聚赖氨酸与安石榴苷复配以提高
ε-聚赖氨酸在生肉中的抑菌性，亦可作为天然高效抑菌剂替代化学防腐剂
。
二者天然安全，符合消费者的健康需求，对菌体生长繁殖抑制的机制互补，具有协同作用的潜力进而具备开发成协同增效的食品防腐剂的可能
。
23.本发明的有益效果：
24.1.
本发明首次发现了
ε-聚赖氨酸和石榴多酚
(
尤其是安石榴苷
)
在抑菌方面具有协同作用，且能够协同提高抗氧化能力，具有作为保鲜剂的潜在能力
。
25.2.
本发明的组合物通过机制协同复配石榴多酚
(
尤其是安石榴苷
)
提高了聚赖氨酸在食品
(
尤其是高蛋白食品或多糖基制品
)
中的抗菌性能，扩宽了其应用范围
。
二者复配有益于解决化学防腐剂带来的病原菌耐药性等风险以及单一的天然保鲜剂应用范围与抑菌谱有限的问题，开发一种安全高效的天然复配型保鲜剂
。
26.3.
本发明的组合物通过机制协同复配安石榴苷提高了聚赖氨酸在食品
(
尤其是高蛋白食品或多糖基制品
)
中的抗氧化能力，二者复配有益于保护食品色泽，推迟食品的氧化变质，延长食品的保藏期
。
附图说明
27.图1为实施例5中以水作为溶剂，不同浓度的
ε-聚赖氨酸和安石榴苷在
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷配方下对
s.aureus、e.coli
抑菌圈直径的理论加和值和实际值比较结果图；
28.其中，相同浓度不同组间的差异用小写字母表示，字母不同表示具有显著性差异
(p《0.05)
；
29.a
为
ε-聚赖氨酸和安石榴苷以
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷配方复配，在终浓度分别为
10mic(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
；
15mic(56.25
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.703mg/ml
安石榴苷
)
；
20mic(75
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.9375mg/ml
安石榴苷
)
复配
时，对
s.aureus
抑菌圈直径的理论加和值与实际值比较的结果图；
30.b
为
ε-聚赖氨酸和安石榴苷以
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷配方复配，在浓度分别为
10mic(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
)
；
15mic(56.25
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+9.375mg/ml
安石榴苷
)
；
20mic(75
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+12.5mg/ml
安石榴苷
)
复配时，对
e.coli
抑菌圈直径的理论加和值与实际值比较的结果图；
31.图2为实施例6中以水作为溶剂，
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷
、
复配组合物
(
以
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷复配
)
对
s.aureus、e.coli
的时间杀菌曲线结果图
32.其中，同一时间组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异显著
(p《0.05)
；各抑菌剂终浓度为
10mic
时；a为
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、1.875mg/ml
安石榴苷；
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
、
无菌水对
s.aureus
的时间杀菌曲线结果图；
33.b
为
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、25mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
、
无菌水对
e.coli
的时间杀菌曲线结果图
。
34.图3为实施例7中，为
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷
、
复配组合物的
dpph
自由基清除率结果图；
35.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
36.a
为
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、1.875mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
(combination 1
，即为组合物
1)
的
dpph
自由基清除率结果图；
37.b
为
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、25mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
(combination 2
，即为组合物
2)
的
dpph
自由基清除率结果
。
38.图4为实施例8中为
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷
、
复配组合物的
abts
自由基清除率结果图；
39.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
40.a
为
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、1.875mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
(combination 1
，即为组合物
1)
的
dpph
自由基清除率结果图；
41.b
为
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、25mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
(combination 2
，即为组合物
2)
的
abts
自由基清除率结果图
。
42.图5为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉失重率的测定结果图；
43.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
44.a
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间的失重率变化测定结果图；
45.b
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
20℃
下保存不同时间的失重率变化测定结果图；
46.c
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
30℃
下保存不同时间的失重率变化测定结果图；
47.图6为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉
ph
值的测定；
48.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
49.a
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间的
ph
变化测定结果图；
50.b
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
20℃
下保存不同时间的
ph
变化测定结果图；
51.c
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
30℃
下保存不同时间的
ph
变化测定结果图；
52.图7为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉
tvb-n
含量的测定；
53.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
54.a
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间的
tvb-n
含量变化测定结果图；
55.b
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
20℃
下保存不同时间的
tvb-n
含量变化测定结果图；
56.c
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
30℃
下保存不同时间的
tvb-n
含量变化测定结果图；
57.图8为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉
tbars
值的测定；
58.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
59.a
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间后的丙二醛含量变化测定结果图；
60.b
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
20℃
下保存不同时间后的丙二醛含量变化测定结果图；
61.c
为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
30℃
下保存不同时间后的丙二醛含量变化测定结果图；
62.图9为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉菌落总数的测定图；
63.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
64.a、b
和c分别为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃、20℃
和
30℃
下保存不同时间后菌落总数变化测定结果图；
65.图
10
为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉色度
l*
值的测定图；
66.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
67.a、b
和c分别为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和
保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃、20℃
和
30℃
下保存不同时间后牛肉
l*
值变化测定结果图；
68.图
11
为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉色度
a*
值的测定图；
69.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
70.a、b
和c分别为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃、20℃
和
30℃
下保存不同时间后牛肉
a*
值变化测定结果图；
71.图
12
为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉质构的测定图；
72.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
a、b、c、d、e
和f分别为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间后牛肉硬度
、
咀嚼性
、
弹性
、
粘附性
、
内聚性和回复性变化测定结果图；
73.图
13
为不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉的感官评价图；
74.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
75.a、b
和c分别为牛肉在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃、20℃
和
30℃
下保存不同时间后感官评分变化测定结果图；
76.图
14
为魔芋豆腐失重率的测定图；
77.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
78.a
和b分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
和
25℃
下保存不同时间后失水率变化测定结果图；
79.图
15
为魔芋豆腐
ph
值的测定图；
80.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
81.a
和b分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
和
25℃
下保存不同时间后
ph
变化测定结果图；
82.图
16
为魔芋豆腐菌落总数的测定图；
83.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
84.a
和b分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
和
25℃
下保存不同时间后菌落总数变化测定结果图；
85.图
17
为魔芋豆腐色度的测定图；
86.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
87.a、b
和c分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间后
l*
值
、a*
值和
b*
值变化测定结果图；
88.d、e
和f分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
25℃
下保存不同时
间后
l*
值
、a*
值和
b*
值变化测定结果图；
89.图
18
为魔芋豆腐全质构测定图；
90.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
91.a、b、c、d
和e分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
下保存不同时间后硬度
、
咀嚼性
、
内聚性
、
弹性和回复性变化测定结果图；
92.图
19
为魔芋豆腐全质构测定图；
93.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
94.a、b、c、d
和e分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
25℃
下保存不同时间后硬度
、
咀嚼性
、
内聚性
、
弹性和回复性变化测定结果图；
95.图
20
为魔芋豆腐感官评价图；
96.其中，不同组间差异用小写字母表示，字母不同表示差异性显著
(p《0.05)
；
97.a
和b分别为魔芋豆腐在无菌水
、
ε-聚赖氨酸
(37.5
μ
g/ml)、
安石榴苷
(0.469mg/ml)
和保鲜剂
1(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)
处理后于
4℃
和
25℃
下保存不同时间后感官评分变化测定结果图
。
具体实施方式
98.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解，但不应以此限制本发明的保护范围
。
99.实施例1ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷的最小抑菌浓度
、
最小杀菌浓度的检测
100.分别测定了
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷的最小抑菌浓度，选用微量稀释法测定，在
96
孔板中进行，具体操作如下：
101.①
：在
96
孔板每个孔加入已灭菌的营养肉汤
100
μ
l
；
102.②
：在
1/2/3
三列的第一孔加配好的
100
μ
l
药液，然后对其进行二倍稀释
。
103.即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打
(
至少三次以上
)
使药液与肉汤充分混匀，然后吸取
100
μ
l
加入往下的第二孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取
100
μ
l
弃去；
104.③
：再在每一孔中加入稀释好的菌液
100
μ
l(
约
104cfu/ml)
，这样就形成测定一个样品
mic
值的三次重复
(1/2/3
三排样品
)。
此时每孔
ε-聚赖氨酸的终浓度从上到下依次为：
480、240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.875(
单位：
μ
g/ml)
105.④
：在同一块板上的
4/5/6
三列加配好的安石榴苷，终浓度为：
3、1.5、0.75、0.375、0.1875、0.09375、0.046875、0.0234375(
单位：
mg/ml)
，
7/8/9
为山梨酸钾作为阳性对照，终浓度为：
32、16、8、4、2、1、0.5、0.25(
单位为
mg/ml)
，
10/11/12
列为无菌水作为阴性对照，除了阴性对照，其他都进行二倍稀释操作，方法同第二步和第三步
。
106.⑤
：将
96
孔板放入
37℃
恒温培养箱
24h
后，每个孔都加
50
μ
l 0.2mg/ml
的
int
显色剂，然后再在
37℃
恒温培养箱中培养半个小时，待显色后记录实验结果
。
107.⑥
：根据
mic
结果，在上述培养
24h
后的
96
孔板中每孔取
100
μ
l
于固体培养基中，用无菌接种环轻推，将平皿置于
37℃
培养箱中培养
24h
，观察有无细菌生长，以培养皿中计数
少于5个菌落作为受试菌的
mbc。
结果见表1和表
2。
108.表1ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷及山梨酸钾对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的
mic
[0109][0110]
表1结果表明：对
s.aureus
，山梨酸钾的
mic
为
ε-聚赖氨酸的
533
倍，为安石榴苷的
42
倍
。
对
e.coli
，山梨酸钾的
mic
为
ε-聚赖氨酸的
266
倍，为安石榴苷的
1.6
倍
。
说明
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的抑菌性显著强于山梨酸钾
。
表明
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的抑菌效果均强于山梨酸钾，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌
。
[0111]
表2ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷和山梨酸钾对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的
mbc
[0112][0113]
表2结果表明：对
s.aureus
，山梨酸钾的
mbc
为
ε-聚赖氨酸的
1.5
×
10-4
倍，减少了4个数量级；为安石榴苷的
0.12
倍
。
对
e.coli
，山梨酸钾的
mbc
为
ε-聚赖氨酸的
7.5
×
10-5
倍，减少了5个数量级；为安石榴苷的
0.4
倍
。
说明
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的杀菌性显著强于山梨酸钾
。
[0114]
实施例2ε-聚赖氨酸和安石榴苷的协同抑菌浓度指数
(fici)
和协同杀菌浓度指数
(fbci)
测定
[0115]
用棋盘实验法测定
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的协同抑菌指数
fici
，测定步骤如下，结果见表3至表
6。
[0116]
根据单药抑菌实验结果，按棋盘法
(checker-board titration)
略作改良进行测定
。
取
96
孔聚苯乙烯微孔板，用微量移液器在第1～8列沿
x
轴方向
(
从左到右
)
每列孔中依次加入终浓度为
2mic、1mic、1/2mic、1/4mic、1/8mic、1/16mic、1/32mic、1/64mic
的
ε-聚赖氨酸
25
μ
l。
以同样方法在第a～f行沿y轴方向
(
从上到下
)
每行孔中依次加入终浓度为
2mic、1mic、1/2mic、1/4mic、1/8mic、1/16mic、1/32mic、1/64mic
的安石榴苷
25
μ
l
，将两药混合均匀
。
依次加入
104cfu/ml
菌液
50
μ
l
，最后加入营养肉汤培养基
50
μ
l。
加液完成后加盖上板，轻微振荡混匀，置于恒温培养箱中
37℃
培养
24h
后观察结果
。
分级抑菌浓度指数
(fractional inhibitory concentration index
，
fici)
为抑菌剂药效学参数之一，是评价两种抑菌剂联合药效的指标
。
[0117]
fici
指数的计算方法如下
:
[0118]
fici
＝联用时复配组合物
mic
中a药的分浓度
/a
药单用时的
mic+
联用时复配组合物
mic
中b药的分浓度
/b
药单用时的
mic。
[0119]
其中
fici《0.5
，是协同作用；
0.5《fici≤1
，是部分协同或相加作用；
1《fici≤2
，是
无关作用；
fici》2
时是拮抗作用
。
[0120]
此外，将
mic
替换为
mbc
并重复上述实验步骤，然后用分级杀菌指数
(fbci)
来评价
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的协同杀菌效果
。fbci
指数的计算方法如下：
[0121]
fbci
＝联用时复配组合物
mbc
中a药的分浓度
/a
药单用时的
mbc+
联用时复配组合物
mbc
中b药的分浓度
/b
药单用时的
mbc。
[0122]
其中
fbci《0.5
，是协同作用；
0.5《fbci≤1
，是部分协同或相加作用；
1《fbci≤2
，是无关作用；
fbci》2
时是拮抗作用
。
[0123]
表3ε-聚赖氨酸与安石榴苷对
s.aureus
的联合抑菌效果
(fici)
[0124][0125]
注：
“‑”
表示不长菌，“+”表示长菌，
fici≤0.5
表示协同
[0126]
表4ε-聚赖氨酸与安石榴苷对
e.coli
的联合抑菌作用
(fici)
[0127][0128]
注：
“‑”
表示不长菌，“+”表示长菌，
fici≤0.5
表示协同
[0138]
具有高效抗氧化抑菌效果的组合物1包括
ε-聚赖氨酸和安石榴苷；且组合物1为水溶液，其中，组合物1中，
ε-聚赖氨酸的浓度为
37.5
μ
g/ml
和安石榴苷的浓度为
0.469mg/ml。
[0139]
实施例4[0140]
具有高效抗氧化抑菌效果的组合物2包括
ε-聚赖氨酸和安石榴苷；且组合物2为水溶液，其中，组合物2中，
ε-聚赖氨酸的浓度为
37.5
μ
g/ml
和安石榴苷的浓度为
6.25mg/ml。
[0141]
实施例5抑菌圈直径测定
[0142]
考察了
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷
、
复配组合物对
s.aureus、e.coli
抑菌圈直径的影响，通过计算抑菌圈直径的理论加和值，与复配组合物的实际抑菌圈直径进行比较，评价两种单药协同抑菌效果
。
具体方法如下：
[0143]
用移液枪吸取
100
μ
l 104cfu/ml
的菌液于营养琼脂培养基中，用涂布棒涂布均匀
。
接着，用镊子夹取
6mm
药敏片，贴于培养基表面，每个平皿贴四片，最后吸取
20
μ
l
的抑菌剂滴于药敏片
。
共4个组，即无菌水组
、
ε-聚赖氨酸组
、
安石榴苷组
、
复配组
(
配方为
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷
)
，浓度为
10mic、15mic、20mic。
平皿静置
5min
后倒置，于
37℃
培养箱中培养
24h。
观察抑菌圈大小，并用数显游标卡尺，以十字交叉法测量抑菌圈直径
(mm)
，每组3个平行，测定后取平均值
。
[0144]
为了判断两中抑菌剂复配的效果，常将复配后抑菌效果的理论加和值与实测值进行比较
。
实测值大于理论加和值，说明复配后具有协同抑菌作用
。
两药复配理论加和值为a药浓度为
mic
时单独作用的效应与b药浓度为
mic
时的单独作用的效应的和的一半，即d＝
1/2da+1/2db。
其中，d为复配组合物的理论加和值，
da为浓度为
mic
的
ε-聚赖氨酸的抑菌圈直径，
db为浓度为
mic
的安石榴苷的抑菌圈直径
。
各抑菌剂具体浓度如下，结果如图
1。
[0145]
对
s.aureus(
终浓度
)
：
[0146]
10mic
：
[0147]
①
ε-聚赖氨酸组：
150
μ
g/ml
；
[0148]
②
安石榴苷组：
1.875mg/ml
；
[0149]
③
复配组
(
组合物
1)
：
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
[0150]
15mic
：
[0151]
①
ε-聚赖氨酸组：
226
μ
g/ml
；
[0152]
②
安石榴苷组：
2.8125
μ
g/ml
；
[0153]
③
复配组：
56.25
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.703mg/ml
安石榴苷
[0154]
20mic
：
[0155]
①
ε-聚赖氨酸组：
300
μ
g/ml
；
[0156]
②
安石榴苷组：为
37.5mg/ml
；
[0157]
③
复配组：
75
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.9375mg/ml
安石榴苷
[0158]
对
e.coli(
终浓度
)
：
[0159]
10mic
：
[0160]
①
ε-聚赖氨酸组：
150
μ
g/ml
；
[0161]
②
安石榴苷组：
25mg/ml
；
[0162]
③
复配组
(
组合物
2)
：
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
[0163]
15mic
：
[0164]
①
ε-聚赖氨酸组：
226
μ
g/ml
；
[0165]
②
安石榴苷组：
37.5
μ
g/ml
；
[0166]
③
复配组：
56.25
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+9.375mg/ml
安石榴苷
[0167]
20mic
：
[0168]
①
ε-聚赖氨酸组：
300
μ
g/ml
；
[0169]
②
安石榴苷组：
50mg/ml
；
[0170]
③
复配组：
75
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+12.5mg/ml
安石榴苷
[0171]
如图1所示，复配组合物对
s.aureus
和
e.coli
的抑菌圈直径实际值显著高于理论加和值
(p《0.05)。
且随着浓度的增大，复配组的抑菌圈直径随之增大，而理论加和值基本维持在
8mm。
对
s.aureus
，
10mic、15mic、20mic
下，复配组抑菌圈直径比理论加和值分别增加了
22.58
％
、29.69
％
、32.67
％
。10mic
到
20mic
，理论加和值仅增加
0.67mm
，而复配组的抑菌圈直径增加了
1.67mm
，为理论加和值的
2.5
倍
。
对
e.coli
，
10mic、15mic、20mic
下，复配组抑菌圈直径比理论加和值分别增加了
30.61
％
、30.10
％
、35.85
％
。
在
10mic
到
20mic
，复配组抑菌圈直径增加了
1.33mm
，为理论加和值增加量的2倍
。
以上结果表明
ε-聚赖氨酸与安石榴苷的组合物具有显著的协同抑菌效果
。
[0172]
实施例6时间杀菌曲线测定
[0173]
以水作为溶剂，通过考察浓度为
10mic
的
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷和复配保对
s.aureus、e.coli
的时间杀菌曲线，来比较抑菌剂单独使用和复配组合物的抑菌能力，以此验证复配组合物的抑菌效果
。
具体操作如下：
[0174]
首先进行菌种活化
。
从甘油管取
1ml
菌液到
100ml
已灭菌的
nb
培养基中，
37℃
培养
24h(
活化后菌液浓度约为
108cfu/ml)。
取
1ml
已活化的菌液加到
99ml
无菌水中，混合均匀后再吸
1ml
上述溶液到
99ml
无菌水中，混合均匀得到稀释
10000
倍的菌液，菌液浓度约为
104cfu/ml。
[0175]
将
104cfu/ml
菌液分装到4×7×
3(4
组
×7个时间点
×3平行
)
根试管中，每个试管加入菌液
5ml。
随后，分别于对应组别的试管中加入
1ml
无菌水
、
ε-聚赖氨酸
、
安石榴苷和复配组合物
(
配方为
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷
)
，接着在每根试管中加入
4ml nb
培养基，摇匀备用
。
将试管置于
37℃
恒温水浴摇床中培养
0h
，
2h
，
4h
，
8h
，
12h
，
18h
和
24h。
在对应时间取出试管，进行梯度稀释后涂布到已备好的
na
平皿，在
37℃
恒温培养箱中倒置培养
24h
后计算菌落数，记录结果
。
此实验中，各抑菌剂终浓度为
10mic
，具体如下，结果如图
2。
[0176]
对
s.aureus(
终浓度
)
：
[0177]
①
ε-聚赖氨酸组：
150
μ
g/ml
；
[0178]
②
安石榴苷组：
1.875mg/ml
；
[0179]
③
复配组
(
组合物
1)
：
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
[0180]
对
e.coli(
终浓度
)
：
[0181]
①
ε-聚赖氨酸组：
150
μ
g/ml
；
[0182]
②
安石榴苷组：
25mg/ml
；
[0183]
③
复配组
(
组合物
2)
：
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
[0184]
图2结果显示，随时间增加，对照组和单抑菌剂组的菌落总数迅速增加，而复配组始终维持在较低水平，低于对照组和单抑菌剂组，且菌落总数差距随时间增加而增加
。
对
聚赖氨酸
、
安石榴苷和复配组合物混合
(
以
1/4mic
ε-聚赖氨酸
+1/4mic
安石榴苷为配方
)
，选用
s.aureus
的
mic
时，各组浓度为：
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸；
1.875mg/ml
安石榴苷；
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
(
组合物1，即为
combination 1)。
选用
e.coli
的
mic
时，各组浓度为：
150
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸；
25mg/ml
安石榴苷；
37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+6.25mg/ml
安石榴苷
(
组合物2，即为
combination 2)
，混合均匀后避光条件下反应
6min
，于
734nm
处测定吸光值
。
以无水乙醇代替样品提取液作为空白，每组3个平行
。abts
自由基清除率的计算公式为：
[0197]
abst scavenging rate(
％
)
＝
(a
0-a1)/a0×
100
，式中
a0和
a1分别为空白组和样品组的吸光值
。
[0198]
图4结果显示，组合物
1(58.08
％
)
的
abts
自由基清除率比理论加和值
(40.97
％
)
增加了
17.11
％；组合物
2(67.78
％
)
的
abts
自由基清除率比理论加和值
(47.30
％
)
增加了
20.48
％，且
combination
组和理论加和值存在显著差异
。
表明
ε-聚赖氨酸和安石榴苷复配后具有协同抗氧化作用
。
[0199]
实施例
10
[0200]
保鲜剂1包括实施例3的组合物
1(
简称
ε-pl/pu)。
[0201]
一
.
验证上述实施例
10
的保鲜剂1保鲜牛肉的效果实验
[0202]
1.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉失重率的测定
[0203]
以
1/4mic
ε-pl+1/4mic pu
配方制备保鲜剂
1(
ε-pl/pu)
，其中
ε-pl、pu
和
ε-pl/pu
中有效成分的浓度分别为
(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、0.469mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)。
将浸泡保鲜液后的牛肉样品沥干后置于无菌培养皿中，在
4℃
冰箱
、20℃
和
30℃
培养箱中保存
。
按照国家卫生标准来进行理化检测牛肉的新鲜度
。
[0204]
首先，新鲜牛肉分割成块，每块各
10g。
在无菌水
、
ε-pl、pu、
ε-pl/pu
中浸泡
30s
，取出沥干
。
接着放入预先贴好的标签的无菌培养皿中，每个时间点至少三个平行
。
最后，将这些样品在
20℃
和
30℃
下储存
。
分别在
0d、1d、2d、3d、4d
测定失重率
。
[0205]
另取新鲜的肉样，经过上述相同处理后置于
4℃
储存
。
分别在
0d、2d、4d、6d、8d、10d
测定失重率
。
[0206]
处理后的肉样分别在不同处理时间取出，称重，按公式计算肉样失重率
(w)。
[0207]w＝
(w
1-w0)/w0×
100
％
[0208]
其中
w1(g)
为储存后肉样重量，
w0(g)
为储存前肉样的重量
。
[0209]
结果表明：随时间和温度的增加，牛肉失重率变化加剧
。4℃
下，对照组的失重率在
6d
内迅速升高，而
ε-pl/pu
组一直维持的较低水平，
6d
时对照组失重率增大为
ε-pl/pu
组的
1.42
倍；
20℃
下，对照组失重率在
4d
内持续上升，增加了
47.75
％，而
ε-pl/pu
组在
2d
内维持在
9.80
％，之后逐渐上升至
28.49
％
。2d
时
ε-pl/pu
组失重率比对照组减小一倍以上；
30℃
下对照组失重率迅速增加，
4d
时失重率
(57.69
％
)
比
ε-pl/pu
组
(34.74
％
)
增高
22.95
％
。
而
ε-pl/pu
在
2d
内维持在
15.36
％内，并在
3d
后保持缓慢增加
。
表明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1能够提高牛肉的持水性
(
图
5)。
[0210]
2.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉
ph
值的测定
[0211]
样品肉的处理同实施例9所述
。
参照
gb 4789.3-2010
的方法测定样品的
ph
值
。
将肉块剁碎后，称取
20g
置于加入
200ml
蒸馏水中静置，每
5min
用玻璃棒搅拌均匀
。30min
后过滤，
取上清液进行测定
。
每个处理组的样品测定3次，平均值为样品一定贮藏时间内的
ph
值
。
新鲜度评价标准如下：变质肉
≥6.4
；
6.2≤
二级鲜度
≤6.4
；
5.8≤
一级鲜度
≤6.2。
[0212]
结果表明：
4℃
贮藏下的牛肉，
ph
随时间增加持续上升，
6d
时对照组
ph
＝
7.02》6.4
，发生变质；而
ε-pl/pu
组仍维持在较低水平，
ph
＝
5.85《6.2
，牛肉保持在一级鲜度
。6d
时对照组
ph
比原来增加了
19.06
％，而
ε-pl/pu
组
ph
仅增加
2.93
％
。
直至第
10d
，牛肉
ph
才超出
6.4
，发生腐败变质
。20℃
下，对照组的牛肉
ph
在
2d
内迅速增加，
2d
时
ph
比原来增加
20.23
％，此时
ph
＝
6.78》6.4
，牛肉发生腐败变质；而
ε-pl/pu
组
ph
在
2d
内仍维持在较低水平，仅增加
3.45
％，此时
ph
＝
5.8《6.2
，牛肉仍保持在一级鲜度
。2d
后
ε-pl/pu
组牛肉
ph
缓慢上升，
3d
时
ph
接近
6.4
，达到腐败期
。30℃
下牛肉的
ph
在
2d
内迅速增加，
2d
时对照组
ph
＝
7.24》6.2
，比原来增加
27.02
％，牛肉发生腐败
。
而
ε-pl/pu
组在
2d
时
ph
仍维持在为
6.19《6.2
，仅比原来增加
8.53
％，牛肉仍保持在一级鲜度
。
表明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1能够提高牛肉的品质
(
图
6)。
[0213]
3.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉
tvb-n
含量的测定
[0214]
样品肉的处理同实施例9所述
。
按照
gb 5009.228-2016《
食品安全国家标准食品中挥发性盐基总氮的测定
》
中第二法，自动凯氏定氮仪法测定肉样中的挥发性盐基氮含量
。
取
10g
肉样切碎置于锥形瓶，加入
50ml
蒸馏水，震荡
15min
后室温下静置
20min
，过滤取滤液，通过自动凯式定氮仪对肉样的
tvb-n
含量进行测定
。
国标规定
tvb-n
含量大于
15mg/100g
为变质肉
。
[0215]
结果表明：随着贮藏时间和温度的增加，
tvb-n
增大
。
在
4℃、20℃、30℃
下，
ε-pl/pu
组的
tvb-n
值显著低于无菌水组和单药组
(p《0.05)。
表明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1能够延长牛肉的保质期
(
图
7)。
[0216]
4.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉
tbars
值的测定
[0217]
样品肉的处理同实施例9所述
。
按照
gb 5009.181-2016《
食品安全国家标准食品中丙二醛的测定
》
中的分光光度法测定样品的
tbars
值
。
称取样品
5g(
精确到
0.01g)
置入
100ml
具塞锥形瓶中，准确加入
50ml
三氯乙酸混合液，摇匀后加塞密封，置于恒温振荡器上
50℃
振摇
30min
，取出冷却至室温
。
用双层定量慢速滤纸过滤弃去初滤液后，取滤液备用
。
准确移取上述滤液和标准系列溶液各
5ml
分别置于
25ml
具塞比色管内，另取
5ml
三氯乙酸混合液作为样品空白，分别加入
5ml
硫代巴比妥酸水溶液
(tba)
，加塞混匀
。
置于
90℃
水浴内反应
30min
，取出冷却至室温
。
以样品空白调节零点，于
532nm
处测定样品溶液和标准系列溶液的吸光度值，以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线
。
一般认为肉中的
tbars
值超过
0.6mg/kg
时，判断为肉变质
。
[0218]
结果表明：各处理组牛肉的
tbars
值随着时间和温度的增加而增加
。
对照组及
ε-pl
组增加速度显著高于
pu
和
ε-pl/pu
组
(p《0.05)。
ε-pl/pu
能够将
4℃
牛肉的保质期从
6d
延长至
10d。20℃
对照组牛肉在
1d
时已接近腐败变质，而
ε-pl/pu
组牛肉在
3d
才发生腐败
。
ε-pl/pu
能够将
30℃
牛肉的保质期从
1d
延长至
2d。
表明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1能显著延缓牛肉中的不饱和脂肪酸发生氧化反应
(
图
8)。
[0219]
5.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉菌落总数的测定
[0220]
样品肉的处理同实施例9所述
。
参照
gb 4789.2-2016《
食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
》
的方法测定样品中细菌的总数
。
一般把肉制品的细菌总数超过
106cfu/g
时作为肉腐败的标准，许多国家也把
106cfu/g
作为肉类食品的细菌总数安全指标
。
针对这个结论，本试验将冷鲜牛肉菌落总数的对数值超过6的样品定为牛肉发生腐败变质，到达腐败期
。
各处理组样品的保质期即为菌落总数对数值小于6但接近该值的贮藏时间
。
[0221]
结果表明：
4℃
下，对照组菌落总数在
8d
迅速增加，
ε-pl/pu
组在
6d
时的菌落总数
(2.52
×
107cfu/g)
比对照组
(4.00
×
104cfu/g)
减少3个数量级
。
与对照组相比，
ε-pl/pu
组可将
4℃
牛肉的保质期从
4d
延长至
8d。
且从第
2d
起，
ε-pl/pu
的菌落总数比对照组减少2个数量级以上
。20℃
下，对照组牛肉在
1d
时菌落总数达
1.55
×
106cfu/g
，已经超出国标规定值，而
ε-pl/pu
组为
8.43
×
103cfu/g
，比对照组减少2个数量级以上
。
在
3d
时，
ε-pl/pu
组菌落总数才接近
106cfu/g
，
ε-pl/pu
能将牛肉在
20℃
下的保质期从
1d
延长至
3d。
在
30℃
下，对照组牛肉菌落总数在
2d
内迅速增加，而
ε-pl/pu
组在
2d
内微生物生长较缓慢
。2d
时，
ε-pl/pu
组菌落总数
(3.14
×
105cfu/g)
比对照组
(6.97
×
107cfu/g)
降低2个数量级，仍然在国标规定范围内
。
综上，
e-pl/pu
能将牛肉在
30℃
下的保质期从
1d
延长至
3d。
表明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1能延缓牛肉腐败
(
图
9)。
[0222]
6.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉色度的测定
[0223]
样品肉的处理同实施例9所述
。
用色差仪测定肉样在储存期间的
l*
值
(
明度
)
，
a*
值
(
红度
)
来评价贮藏期内色差变化，测试前使用配套光阱和白板进行校正，光源
d65
，观察角
10
°
，测试光孔直径
10mm。
用滤纸将样品表面水分擦干，重复测量三次，每次测三个不同部位，取平均值
。
[0224]
结果表明：各温度下，4个处理组的
l*
值均呈现先增大后减小的趋势
。
在
4℃
下，在
2d
内，无菌水和
ε-pl
的
l*
值显著高于
pu
组和
ε-pl/pu
组
。30℃
下，无菌水组和
ε-pl/pu
组的
l*
值在
3d
内分别降低了
47.30
％
、31.55
％
。
与无菌水相比，
ε-pl/pu
组的颜色变化程度较低，说明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1很好抑制了微生物的繁殖和脂质氧化
(
图
10
～
11)。
[0225]
7.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉质构的测定
[0226]
将样品牛肉切成
1cm
×
1cm
×
1cm
的肉块，使用
ta.tx.plus
质构仪，加载
p/75
探头，以“二次压缩”模式进行测定
。
其中压缩比
75
％，测前速度：
2.0mm/s
，测中速度：
1.0mm/s
，测后速度：
1.0mm/s
，触发力：
0.001n
，时间间隔：
5s。tpa
参数包括：硬度
(hardness)、
黏附性
(adhesiveness)、
弹性
(springiness)、
内聚性
(cohesiveness)、
咀嚼性
(chewiness)
和回复性
(resilience)。
每组样品平行测定5次
。
[0227]
结果表明：
8d
内对照组和
e-pl/pu
组硬度分别下降
73.16
％
、49.77
％，且相同的储藏期下，
ε-pl/pu
组肉样的硬度显著高于对照组肉样
(p《0.05)。
说明
ε-pl/pu
组能够延迟牛肉的变软
。
对照组和
ε-pl/pu
组的牛肉咀嚼性随贮藏时间的延迟不断下降，
8d
内分别下降了
34.66
％
、8.21
％，且从第
4d
开始存在显著差异
(p《0.05)。8d
内对照组和
ε-pl/pu
组牛肉弹性分别下降了
58.06
％
、41.26
％；粘附性分别下降了
486.8
％
、269.1
％
。
回复性和内聚性变化规律相似，
0-8d
内对照组和
ε-pl/pu
组肉样无显著性差异
。8d
后，对照组和
ε-pl/pu
组内聚性分别下降了
22.29
％
、17.22
％；回复性分别下降了
36.96
％
、28.74
％
。
说明含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的保鲜剂1保鲜的能维持牛肉的品质
(
图
12)。
[0228]
8.
不同温度处理下保鲜剂1保鲜的牛肉的感官评价
[0229]
样品肉的处理同实施例9所述
。
[0230]
参考
gb/t 17238-2008《
鲜
、
冻分割牛肉
》
并略作改动
。
按照表8感官评分标准进行感官评分
。
[0231]
表8感官评分标准
[0232][0233][0234]
结果表明：在
4℃、20℃
和
30℃
经过
ε-pl/pu
处理的牛肉，感官得分高于其他三组
。
四组牛肉的综合感官评分在贮藏时间均呈下降的趋势，其中对照组下降最快，
ε-pl
与无菌水组变化相似，
ε-pl/pu
组和
pu
组的感官变化较小
。
这是因为
ε-pl/pu
组有良好的抑菌性和抗氧化性，可抑制微生物繁殖代谢，延缓了脂肪氧化和蛋白质氧化，从而维持牛肉品质
。
说明，含有
ε-聚赖氨酸和安石榴苷的能够延长牛肉的保质期
(
图
13)。
[0235]
二
.
验证上述实施例
10
的保鲜剂1保鲜魔芋豆腐的效果实验
[0236]
1.
魔芋豆腐失重率的测定
[0237]
以
1/4mic
ε-pl+1/4mic pu
配方制备保鲜剂
1(
ε-pl/pu)
，其中
ε-pl、pu
和
ε-pl/pu
的有效成分浓度分别为
(37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
、0.469mg/ml
安石榴苷
、37.5
μ
g/ml
ε-聚赖氨酸
+0.469mg/ml
安石榴苷
)。
在无菌水
、
ε-pl、pu
和
ε-pl/pu
中浸泡
5min
，取出沥干，接着放入预先贴好的标签的无菌保鲜袋中，最后，将这些样品在
4℃
和
25℃
下储存
。
分别在对应时间点取出，测定失重率
。
[0238]
处理后的魔芋豆腐分别在不同处理时间后取出称重，根据公式计算肉样失重率
(w)。
[0239]w＝
(w
1-w0)/w0×
100
％
[0240]
其中
w1(g)
为储存后样品重量，
w0(g)
为储存前样品的重量
。
[0241]
结果表明：
ε-pl/pu
处理能提高魔芋豆腐的持水性，且随着时间的延长，无菌水组与
ε-pl/pu
组失水率差距越显著
。
这可能是因为低浓度多酚的加入使蛋白-多糖体系的表面疏水性下降，因而提高了持水性，加上多肽和多糖共存时，部分基团相互连接，进一步增强了聚合物凝胶性
。
说明保鲜剂1能够提高魔芋豆腐持水性
(
图
14)。
[0242]
2.
魔芋豆腐
ph
值的测定
[0243]
取魔芋豆腐
10g
，加入
10ml
蒸馏水，用组织捣碎机充分捣碎后将
ph
计探头插入，测其
ph
值
。
[0244]
结果表明：在
4℃
和
25℃
下，魔芋豆腐的
ph
值随着时间的增加而下降
。
ε-pl/pu
组的
ph
值在贮藏期内显著高于对照组
(p《0.05)
，
4℃
下
8d
内，
ε-pl/pu
组
ph
基本不变，仅降低
0.033
％，而对照组在
8d
内迅速降低了
2.85
％
。25℃
下，
ε-pl/pu
组在
48h
内维持平稳，仅降低
2.02
％，而对照组降低
4.78
％
。
这是因为保鲜剂1能抑制微生物的生长，因而减缓了
ph
下降
(
图
15)。
[0245]
3.
魔芋豆腐菌落总数的测定
[0246]
参照
gb 4789.2-2016《
食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
》
的方法测定样品中细菌的总数
。
一般把魔芋豆腐的细菌总数超过
106cfu/g
时作为腐败的标准
。
各处理组样品的保质期即为菌落总数对数值小于6但接近该值的贮藏时间
。
称取
10g
魔芋豆腐，在已灭菌的锥形瓶中加入
90ml
生理盐水，将魔芋豆腐捣成匀浆，混匀，作为
101。
连续稀释几个浓度，以倾注法倒平板，在
37℃
倒置培养
48h
后计数并记录，每个稀释度做3个平行
。
[0247]
结果表明：
ε-pl/pu
组魔芋豆腐的菌落总数始终低于对照组，且具有显著性差异
(p《0.05)
，表明
ε-pl/pu
能有效发挥抗菌效力，延长魔芋豆腐的保质期
。
魔芋豆腐
4℃
保存下，对照组在第
5d
时，菌落总数为
7.9
×
105cfu/g
，接近
106cfu/g
，临近腐败期
。
而
ε-pl/pu
组微生物在
2d
内增长迅速，第
2d
后，微生物增长速度放缓，在
14d
时，
ε-pl/pu
组的菌落总数才超过
106cfu/g
，发生腐败变质
。
第
2d
开始，
ε-pl/pu
组菌落总数比对照组降低1个数量级以上
。
因此，
ε-pl/pu
可将
4℃
下的魔芋豆腐保质期延长至
14d
，与对照组相比延长了
9d。25℃
保藏的魔芋豆腐在第
36h
时，对照组的菌落总数
(8.52
×
106cfu/g)
超出
106cfu/g
，而
ε-pl/pu
组在第
36h
菌落数
(1.85
×
104cfu/g)
比对照组降低2个数量级
。
且
ε-pl/pu
组的魔芋豆腐在
48h
时才发生腐败变质
。
因此，
ε-pl/pu
组可将在
25℃
下保藏的魔芋豆腐的保质期延长至
48h
，与对照组相比延长了
12h。
说明保鲜剂1能够有效延缓魔芋豆保质期，且在
4℃
条件下贮藏保质期更长
(
图
16)。
[0248]
4.
魔芋豆腐色度的测定
[0249]
将魔芋豆腐切平铺于桌面上，色度仪经校正后，测定魔芋豆腐的颜色，记录
l*
值
(
明度
)
，
a*
值
(
红度
)
，
b*
值
(
黄度
)
，每次取四个位置测定，重复测量三次，取平均值
。
[0250]
结果表明：从
12h
开始，
4℃
下各组
l*
值总体呈上升趋势，其中
ε-pl/pu
组
l*
值变化最缓慢
。12h-14d
内
ε-pl
组
、pu
组
、
ε-pl/pu
组和对照组分别增加了
20.28
％
、20.13
％
、18.74
％
、23.91
％
。
这是因为魔芋豆腐在贮藏过程发生腐败，表面会起白层，使得
l*
值增加，其次，魔芋豆腐持水性下降，水分渗出表面，光反射导致
l*
值增加
。
而
ε-pl/pu
组持水和抑菌性较好，故
l*
值变化最缓慢
。4℃
下，各组
a*
值和
b*
值基本维持不变
。
含多酚组
b*
值稍稍降低，这是可能是因为
ph
会影响
pu
的颜色
(
图
17)。
[0251]
5.
魔芋豆腐全质构测定
[0252]
将魔芋豆腐切成
2cm
×
2cm
×
2cm
的正方体，重量大小形态保持一致
。
在室温下，用
ta.tx.plus
质构仪测定魔芋豆腐的全质构特性，检测指标有硬度
、
弹性
、
内聚性
、
回复性
、
咀嚼性
(
各指标定义如表
8)。
测试条件为：
p36r
探头；测定前探头速度为
3mm/s
；测定时和测定后探头速度速度均为
1mm/s
；压缩距离为
10mm
；触发力为
5g
；两次下压间隔时间为
2s。
每个时
间点每次测量至少需要5个样品，一个样品测量一次
。
[0253]
表
9 tpa
参数定义
[0254][0255]
结果表明：
4℃
下随看贮藏时间的增加，魔芋豆腐的硬度
、
内聚性
、
咀嚼性
、
弹性和回复性总体呈下降趋势，且
ε-pl/pu
组和
ε-pl
组各值总体高于对照组和
pu
组
。10d
内
ε-pl/pu
组和对照组的硬度
、
内聚性
、
咀嚼性
、
弹性分别降低了
41.46
％和
54.81
％
、16.17
％和
23.13
％
、13.05
％和
31.40
％
、4.68
％和
17.91
％
。
说明经保鲜剂1能够维持魔芋豆腐外观品质
。
图
19
结果表明，
25℃
与
4℃
总体变化趋势一致，但
25℃
魔芋豆腐的质构变化更加剧烈，表明温度也是影响魔芋质构的重要因素，
4℃
下贮藏能更好的保持魔芋豆腐的质地
(
图
18)。
[0256]
6.
魔芋豆腐感官评价
[0257]
按照表
10
的感官评分标准进行感官评分
。
[0258]
表
10
感官评分标准
[0259][0260]
结果表明：在
4℃
下
4d
内，对照组和
ε-pl/pu
组的魔芋豆腐均能够保持良好的感官
性状，感官评分在
30
分左右
。
第
5d
时，对照组感官评分下降至
22
，而
ε-pl/pu
组的感官评分仍维持在
30
分左右，直至第
14d
，
ε-pl/pu
组的感官评分才下降至
19
分
。
这是因为
ε-pl/pu
能使凝胶网络结构更加致密，故其截留水分的能力越好，持水性就越高，维持了魔芋豆腐的硬度
、
咀嚼性
、
弹性和回复性，因而魔芋豆腐品质更好
。
同时，
ε-pl/pu
具有良好的抗菌性能，在
14d
内都能发挥抑菌作用，显著抑制了微生物生长繁殖，抑制了微生物产酸，因此抑制了魔芋豆腐的发酸
。
相同时间下，
25℃
保存的魔芋豆腐的感官得分低于
4℃。
这可能是温度升高加快了各种化学反应，且微生物生长更迅速，进而加速了魔芋豆腐的腐败变质
。
但
ε-pl/pu
组抑菌性较好，可在一定时间内延缓魔芋豆腐的腐败速度
。
在
72h
内，
ε-pl/pu
组感官评分高于对照组，且在
36h
内，
ε-pl/pu
组的感官评分仍维持在
30。
说明保鲜剂1能延长魔芋豆腐的保质期，维持魔芋豆腐的品质
(
图
20)。
[0261]
其它未详细说明的部分均为现有技术
。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围
。