一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，通过将线性重组蛋白进行初折叠和重折叠，精确控制蛋白分子的空间半径，既有利于微滤和超滤膜孔径的精确选型，又可提高蛋白的回收率，联合应用微滤和超滤，分别去除大分子和小分子杂质，同时超滤实现蛋白浓缩，减轻了后期凝胶柱层析分离的负荷，再通过加入尿素，实现重组蛋白折叠后的解旋，避免了有害物的残留。本发明方法获得的重组人源胶原蛋白，纯度可达99％，回收率高于65％，方法操作简便，显著降低了重组人源胶原蛋白的规模化生产的成本，特别适合工业化生产。
【专利说明】
一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物制品分离纯化技术领域，具体涉及一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法。【背景技术】
[0002]胶原蛋白是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族，可作为食品添加剂、饲料添加剂、絮凝剂、照相乳胶材料、表面活性剂盒固定化酶载体材料等，应用于各个工业领域。目前胶原蛋白的生产主要是采用化学提取的方法从动物组织中获得。为了提高胶原蛋白的生物安全性、纯度及活性，拓宽其在化妆品和医疗器械等领域的应用，基因工程技术被广泛用于将人源胶原蛋白基因克隆到细菌、酵母、植物、动物细胞等宿主中，从而表达制备人源胶原蛋白。
[0003]世界专利W0 106494公开了一种类人胶原蛋白及其生产方法，利用大肠杆菌表达获得了类人胶原蛋白；中国专利201110327865.5公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，构建了毕赤酵母重组人源胶原蛋白基因工程菌表达获得了人源胶原蛋白，这两种方法都已经实现了产业化。但是，在人源胶原蛋白产业化过程中，主要的生产成本和工艺难点都集中在分离纯化阶段，尤其是大肠杆菌还需要进行菌体收集和破壁，最后还需进行蛋白复性。毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的分离纯化过程中，存在很多难点，其中利用膜分离和膜脱色的环节成为主要的瓶颈，其原因在于重组人源胶原蛋白的线性结构，首先很难根据线性结构蛋白的真实分子量选择到合适的膜芯，其次线性结构蛋白难以顺利通过膜芯孔隙，容易逐渐累积，造成堵塞，使得膜设备通量迅速下降，无法实现工业化大规模生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种工业上易于实现的重组人源胶原蛋白分离纯化方法， 通过将线性重组蛋白进行初折叠和重折叠，精确控制蛋白分子的空间半径，既有利于微滤和超滤膜孔径的精确选型，又可提高蛋白的回收率，联合应用微滤和超滤，分别去除大分子和小分子杂质，同时超滤实现了蛋白浓缩，减轻了后期凝胶柱层析分离的负荷，再通过加入尿素，实现重组蛋白重折叠后的解旋，避免了有害物的残留。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]—种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，工艺流程如下:巴斯德毕赤酵母菌Pichia pastoris发酵液离心分离后进行线性蛋白重折叠，分别利用微滤去除大分子杂质和超滤去除小分子杂质，除杂后加入尿素诱导解旋，凝胶层析后冷冻干燥即得到纯化的重组人源胶原蛋白，具体步骤为:将巴斯德毕赤酵母菌Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液，上清液先在pH多9的第一缓冲溶液中进行初折叠，再在通入足量空气的、9 < pH彡11 的第二缓冲溶液中进行充分的重折叠，折叠后通入氮气稳定蛋白，之后微滤去除蛋白溶液中的大分子杂质，超滤去除小分子杂质，同时进行蛋白质的浓缩，在浓缩液中加入1?10M的尿素使重折叠蛋白解旋，解旋液经凝胶柱层析纯化，冷冻干燥，得到重组人源胶原蛋白。
[0007]本发明所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.5021，并在中国专利 201110327865.5中充分公开。
[0008]本发明所述的大分子杂质是指分子量大于重组人源胶原蛋白的杂质。
[0009]本发明所述的小分子杂质是指分子量小于重组人源胶原蛋白的杂质。
[0010]所述的的第一缓冲溶液包含以下组分:1.5M尿素，0.4M精氨酸，5?80mM小分子碱， 8mM EDTA(乙二胺四乙酸)。
[0011]所述的第二缓冲溶液包含以下组分:1.5M尿素，25mM半胱氨酸，150mM精氨酸，0.3 ?1.5mM DTT(二硫代苏糖醇)，2?50mM小分子碱，5mM EDTA。[〇〇12]所述的小分子碱为三乙胺或三乙醇胺，优选为三乙胺。
[0013]所述的第一缓冲溶液中的小分子碱的浓度优选为10?25mM，第二缓冲溶液中的小分子碱的浓度优选为15?35mM。[〇〇14]所述的尿素的浓度优选为4?8M。
[0015]所述凝胶柱层析的填料优选为Sephadex G-100。[〇〇16]与现有技术相比，本发明的显著效果如下:本发明通过在分离纯化过程中对线性蛋白的重折叠和解旋，有效控制了蛋白的分子空间半径，线性重组人源胶原蛋白经过折叠和解旋后，其分子量未发生变化，在保证了重组人源胶原蛋白的稳定性的同时避免了除杂过程中蛋白累积造成的滤膜堵塞的问题，且提高了蛋白的回收率。本发明方法获得的重组人源胶原蛋白，纯度可达99%，回收率高于65%，该方法操作简便，显著降低了重组人源胶原蛋白的规模化生产的成本，特别适合工业化生产。【具体实施方式】[0〇17]本发明使用的菌种为:巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号: CGMCCN0.5021，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并在中国专利201110327865.5中充分公开。
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步详述。
[0019]实施例1[0〇2〇](1)将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液。[〇〇21] (2)在上清液中加入含有1.5M尿素、0.4M精氨酸、10mM三乙胺、8mM EDTA的，pH为 9.0的第一缓冲溶液中，37°C温浴30分钟。[〇〇22] (3)在上清液中加入含有1.5M尿素、25mM半胱氨酸、150mM精氨酸、0.3mM DTT、15mM 三乙胺、5mM EDTA，pH为9.3的第二缓冲溶液中，通入足量空气，37°(:温浴8小时，然后通入足量氮气使重叠后的重组人源胶原蛋白稳定。
[0023] (4)将重叠后的蛋白溶液经微滤膜过滤，除去大分子杂质，再经超滤膜过滤，除去小分子杂质并对蛋白进行浓缩。[〇〇24] (5)在浓缩蛋白溶液中加入4M尿素，40 °C解旋2h。[〇〇25] (6)采用Sephadex G-100凝胶装柱，充分平衡后，取800mL解旋溶液，用核酸蛋白仪检测220nm处吸收峰，收集目的蛋白峰。
[0026] (7)将经凝胶柱层析后的蛋白进行真空冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白。
[0027]本实施例获得的重组人源胶原蛋白，通过高效液相色谱分析，测得其纯度为98%， BCA测得蛋白的回收率为67 %。[〇〇28] 实施例2[0〇29](1)将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液。
[0030](2)在上清液中加入含有1 ? 5M尿素、0 ? 4M精氨酸、18mM三乙胺、8mM EDTA，pH为9 ? 5 的第一缓冲溶液中，37°C温浴30分钟。
[0031](3)在上清液中加入含有1.5M尿素、25mM半胱氨酸、150mM精氨酸、0.9mM DTT、15mM 三乙胺、5mM EDTA，pH为10.0的第二缓冲溶液中，通入足量空气，37°C温浴8小时，然后通入足量氮气使重叠后的重组人源胶原蛋白稳定。
[0032](4)将重叠后的蛋白溶液经微滤膜过滤，除去大分子杂质，再经超滤膜过滤，除去小分子杂质并对蛋白进行浓缩。[〇〇33](5)在浓缩蛋白溶液中加入6M尿素，40 °C解旋2h。[〇〇34](6)采用Sephadex G-100凝胶装柱，充分平衡后，取800mL解旋溶液，用核酸蛋白仪检测220nm处吸收峰，收集目的蛋白峰。
[0035](7)将经凝胶柱层析后的蛋白进行真空冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白。[〇〇36]本实施例获得的重组人源胶原蛋白，通过高效液相色谱分析，测得其纯度为99%， BCA测得蛋白的回收率为68 %。[〇〇37] 实施例3[0〇38](1)将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液。[〇〇39](2)在上清液中加入含有1 ? 5M尿素、0 ? 4M精氨酸、25mM三乙胺、8mM EDTA，pH为10 ? 0的第一缓冲溶液中，37°C温浴30分钟。
[0040](3)在上清液中加入含有1.5M尿素，25mM半胱氨酸，150mM精氨酸，1.5mM DTT，35mM 三乙胺，5mM EDTA，pH为11.0的第二缓冲溶液中，通入足量空气，37°C温浴8小时，然后通入足量氮气使重叠后的重组人源胶原蛋白稳定。
[0041](4)将重叠后的蛋白溶液经微滤膜过滤，除去大分子杂质，再经超滤膜过滤，除去小分子杂质并对蛋白进行浓缩。[〇〇42](5)在浓缩蛋白溶液中加入8M尿素，40 °C解旋2h。[〇〇43](6)采用Sephadex G-100凝胶装柱，充分平衡后，取800mL解旋溶液，用核酸蛋白仪检测220nm处吸收峰，收集目的蛋白峰。
[0044](7)将经凝胶柱层析后的蛋白进行真空冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白。
[0045]本实施例获得的重组人源胶原蛋白，通过高效液相色谱分析，测得其纯度为96%， BCA测得蛋白的回收率为67 %。
[0046]对比例[0〇47](1)将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液。
[0048](2)将上清液经微滤膜过滤，除去大分子杂质，再经超滤膜过滤，除去小分子杂质并对蛋白进行浓缩。[〇〇49] (3)采用5叩1^(1^6-100凝胶装柱，充分平衡后，取8001^解旋溶液，用核酸蛋白仪检测220nm处吸收峰，收集目的蛋白峰。
[0050](4)将经凝胶柱层析后的蛋白进行真空冷冻干燥，获得重组人源胶原蛋白。本实施例获得的重组人源胶原蛋白，通过高效液相色谱分析，测得其纯度为98%，BCA测得蛋白的回收率低于40 %。
【主权项】
1.一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下:将巴斯 德毕赤酵母菌Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液，上清液先在pH>9的第一缓冲溶 液中进行初折叠，再在通入足量空气的、9<pH<ll的第二缓冲溶液中进行充分的重折叠， 折叠后通入氮气稳定蛋白，之后微滤去除蛋白溶液中的大分子杂质，超滤去除小分子杂质， 同时进行蛋白质的浓缩，在浓缩液中加入1?10M的尿素使重折叠蛋白解旋，解旋液经凝胶 柱层析纯化，冷冻干燥后得到重组人源胶原蛋白。2.根据权利要求1所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris的保藏编号为CGMCC N0.5021。3.根据权利要求1所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 的第一缓冲溶液包含以下组分:1.5M尿素，0.4M精氨酸，5?80mM小分子碱，8mM乙二胺四乙 酸。4.根据权利要求1所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 的第二缓冲溶液包含以下组分:1.5M尿素，25mM半胱氨酸，150mM精氨酸，0.3?1.5mM二硫代 苏糖醇，2?50mM小分子碱，5mM乙二胺四乙酸。5.根据权利要求3或4所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于， 所述的小分子碱为三乙胺或三乙醇胺。6.根据权利要求3所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 的第一缓冲溶液中的小分子碱的浓度为1 〇?2 5mM。7.根据权利要求4所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 的第二缓冲溶液中的小分子碱的浓度为15?35mM。8.根据权利要求1所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 的尿素的浓度为4?8M。9.根据权利要求1所述的规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，所述 凝胶柱层析的填料为Sephadex G-100。
【文档编号】C07K1/34GK106008702SQ201610585372
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】周爱梅, 黄建民, 高力虎, 赵健烽, 杜尔凤, 冯丽萍, 陶海, 季乐
【申请人】江苏江山聚源生物技术有限公司