1,3,7,9‑四甲基尿酸的制备方法与流程

本发明涉及中药有效成分提取分离工艺领域，特别是涉及一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法。

背景技术：

1,3,7,9-四甲基尿酸(TC)，其结构式如式(I)所示，是天然存在的嘌呤类生物碱，主要存在于苦茶中，具有抗抑郁、镇静催眠和抗炎镇痛等药理作用。由于1,3,7,9-四甲基尿酸在苦茶中的含量少，因此，如何对其进行高得率的制备受到广泛关注。

目前，用于分离1,3,7,9-四甲基尿酸的方法大多为大孔树脂柱层析、正相柱层析及反相柱层析联用。由于大孔树脂柱层析、正相柱层析及反相柱层析方法制备样品得率低、制备量小，无法进行规模化的制备，且污染大、耗时长、成本高。另外在制备过程中需使用到大量的吸附填料，由此容易导致样品原有的生物活性大打折扣，使制备得到的1,3,7,9-四甲基尿酸活性降低，生产效益低下，不适合推广使用。

技术实现要素：

基于此，本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，利用该制备方法制备出的1,3,7,9-四甲基尿酸纯度高，单次制备量大，得率高，并对样品活性无影响，也无外加污染。制备得到的1,3,7,9-四甲基尿酸可用于药品，化妆品，保健品等。

其技术方案如下：

一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，包括如下步骤：

S1、取苦茶提取物作为待分离样品；配制体积比为(0.5～1.5)：(0.5～2)：(1～6)的乙酸乙酯、正丁醇和水的溶剂体系，所述溶剂体系包括上层和下层，在所述上层中添加8～12mmol/L的三乙胺作为固定相，在所述下层中添加8～15mmol/L的盐酸作为流动相，取适量所述流动相溶解所述待分离样品，得待分离溶液；

S2、将所述溶剂体系泵入高速逆流色谱的色谱柱中，将所述待分离溶液泵入高速逆流色谱进行洗脱分离，并根据记录仪得到的逆流色谱图谱判定流份中是否含有1,3,7,9-四甲基尿酸，并收集含有1,3,7,9-四甲基尿酸的流份，干燥得到1,3,7,9-四甲基尿酸。

本发明1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，通过高速逆流色谱对苦茶提取物进行分离提纯，并合理对高速逆流色谱采用的固定相和流动相溶剂体系进行控制，使待分离样品中的1,3,7,9-四甲基尿酸和其余物质可以在固定相和流动相之间获得较佳的分配比例，由此有效提高制得的1,3,7,9-四甲基尿酸的纯度，且得率高。

同时，由于高速逆流色谱不需要固体支撑体，1,3,7,9-四甲基尿酸的分离仅依据其在固定相、流动相中分配系数的不同就可实现，无需大量使用吸附填料，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使1,3,7,9-四甲基尿酸能够充分回收，回收的1,3,7,9-四甲基尿酸更能保持其本来的特性，且由于待分离样品与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高。

在其中一个实施例中，步骤S1中，所述溶剂体系为体积比为1:1.5:3的乙酸乙酯、正丁醇和水。

在其中一个实施例中，步骤S1中，所述固定相中三乙胺的加入量为9～11mmol/L；所述流动相中盐酸的加入量为9～11mmol/L。

在其中一个实施例中，所述固定相的保留值为70～80％。

在其中一个实施例中，步骤S2中，所述高速逆流色谱的参数设置如下：

转速为300～500rpm，分离温度为15～30℃，检测波长为240～260nm，流动相的流速为5～20mL/min。

在其中一个实施例中，所述流动相的流速为6～10mL/min。

在其中一个实施例中，所述分离温度为17～23℃。

在其中一个实施例中，所述转速为400～500rpm。

在其中一个实施例中，所述检测波长为254nm。

在其中一个实施例中，所述色谱柱的体积为1000mL。

在其中一个实施例中，步骤S2中所述固定相和流动相泵入色谱柱的过程为：所述固定相于仪器静态泵入高速逆流色谱柱中，所述流动相于仪器静态泵入色谱柱中。

在其中一个实施例中，步骤S2中所述待分离溶液在固定相、流动相平衡后被泵入色谱柱中。

在其中一个实施例中，单次通过单根色谱柱的待分离样品为10～15g。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，经高速逆流色谱仪分离提纯制备1,3,7,9-四甲基尿酸，该制备方法耗时短，制得的1,3,7,9-四甲基尿酸纯度高、得率高，单次制备量大，可进行规模化的制备且成本低；该采用高速逆流色谱分离的方法因未大量使用吸附填料，对样品活性影响较小，保留了原有的生物活性；制备出的产品也无外加污染，可用于药品，化妆品，保健品等。

附图说明

图1为本发明一实施例的1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法流程图；

图2为实施例1中记录仪记录的高速逆流色谱分离1,3,7,9-四甲基尿酸的逆流色谱图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

如图1为1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法流程图。以下各实施例所用原料均为普通市售产品，其中，苦茶提取物的规格优选为1,3,7,9-四甲基尿酸的质量占比不低于5％。

实施例1

本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，包括如下步骤：

S1、取苦茶提取物11.9g作为待分离样品；配制体积比为1:1.5:3的乙酸乙酯、正丁醇和水的溶剂体系，所述溶剂体系包括上层和下层，在所述上层中添加10mmol/L的三乙胺作为固定相，在所述下层中添加10mmol/L的盐酸作为流动相，取120mL所述流动相溶解所述待分离样品，得待分离溶液；

S2、将所述固定相和流动相泵入高速逆流色谱的色谱柱中，首端进，尾端出；待平衡后，将所述待分离溶液泵入高速逆流色谱进行洗脱分离，并根据记录仪得到的逆流色谱图谱判定流份中是否含有1,3,7,9-四甲基尿酸(出现图2所示图谱说明流份中含有1,3,7,9-四甲基尿酸)，收集含有1,3,7,9-四甲基尿酸的流份，减压回收得到1,3,7,9-四甲基尿酸(经与1,3,7,9-四甲基尿酸的核磁数据对比，证明结构一致)；其中，所述高速逆流色谱的参数设置如下：主机顺时针转动，转速为450rpm，分离温度为17～23℃，检测波长为254nm，流动相的流速为8mL/min，色谱柱体积为1000mL。

实施例2

本实施例本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S2中的溶剂体系为积比为1.5：0.5：1的乙酸乙酯、正丁醇和水。

实施例3

本实施例本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S2中的溶剂体系为积比为0.5：2：6的乙酸乙酯、正丁醇和水。

实施例4

本实施例本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S2中的转速为500rpm。

实施例5

本实施例本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S2中的转速为300rpm。

实施例6

本实施例本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S2中的流速为5mL/min。

实施例7

本实施例本实施例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S2中的流速为20mL/min。

对比例1

本对比例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S1中的溶剂体系为体积比为1:1.5:3的乙酸乙酯、甲醇和水。

对比例2

本对比例一种1,3,7,9-四甲基尿酸的制备方法，步骤类似实施例1，区别在于：步骤S1中的溶剂体系为体积比为1:5:3的乙酸乙酯、正丁醇和水。

以上各实施例和对比例制备得到的待分离样品质量、1,3,7,9-四甲基尿酸质量、固定相保留值及1,3,7,9-四甲基尿酸的纯度见表1。

表1

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。