一种微流控芯片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属微流控芯片技术领域，特别涉及一种微流控芯片及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]细胞培养是药物研发过程中不可缺少的重要步骤，常规的细胞培养在高通量筛药方面有很多不足，而在多水平药物联用筛选方面更是很少涉足，还没有高通量的筛选平台。多种药物多水平联用，能更真实地反映人的实际用药情况，研究药物联用对细胞的影响，模拟人体组织药物之间的互相影响，也有利于快速筛选新药药物联用的疗效和毒性。因此，发展一种便捷、快速、高效、低成本的药物联用筛选技术，是药物筛选和细胞生物学等领域的迫切需求。
[0003]近年来，微流控芯片分析技术已成为分析化学中一个重要的研究方向，是其中最活跃的一支，无论是在科研还是应用领域都获得了广泛的重视。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。现有阶段的基于微流控芯片的细胞分析平台大多是利用同生物相容性好的PDMS硅胶材料作为芯片材料，具有很好的生物相容性，透光透气，实现芯片内的细胞培养和各种生物物理、生物化学刺激以便得到在不同细胞外微环境下细胞的行为变化，诸如存活、增殖、凋亡、分化等。
[0004]微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、多重平行分析、便携式、易操作、成本低等优点，已经在众多领域获得了广泛应用。然而，采用微流控芯片，在其表面制备微结构和微通道，依靠微通道中液体之间的混合效应驱动多种药物进行多水平混合，同时完成细胞的培养及检测，目前在药物联用筛选的应用领域尚未有实质性的突破。
【发明内容】
[0005]本发明涉及一种微流控芯片及其制备方法，该微流控芯片集成有浓度梯度生成单元和混合单元，最终可生成多种药物不同水平的浓度混合刺激固定在特定的细胞培养单元的细胞，在显微镜下可以直观地研究细胞在生长过程中对多药物多水平联用的反应，为大规模的药物联用筛选提供了新思路和新研究技术，主要应用于细胞生物学、遗传学和药物筛选等相关领域，是一种可广泛用于各种细胞分析的新工具。
[0006]—种微流控芯片，所述微流控芯片由2个浓度梯度生成单元，I?10个混合单元和细胞培养单元构成，混合单元的入口为浓度梯度生成单元的药物溶液出口，浓度梯度生成单元的最上端为药物溶液或培养基入口；
[0007]所述的浓度梯度生成单元为一个树状的、从上至下逐层增加分支的结构，每个分支的通道为迂回的折线形，最末端分支数量为混合单元数量的二分之一，且其每一个出口通过一个微通道与混合单元最上端相连，
[0008]所述的混合单元，为浓度梯度单元末端通道分支两个微通道，混合单元快速微通道和混合单元慢速微通道，混合单元快速微通道为长直通道，混合单元慢速微通道为长迂回的折线形通道，每个混合单元的长直通道与对侧的长迂回的折线形通道相连通，长迂回的折线形通道与长直通道的长度比例可以为1:1?10:1。
[0009]所述的细胞培养单元包括细胞培养室，上端为混合单元的药物溶液出口，下端为细胞培养单元出口。
[0010]一种微流控芯片的制备方法，按照以下步骤进行:用计算机辅助设计软件设计和绘制微流控芯片中的微结构和微通道图形，包括浓度梯度生成单元、混合单元、细胞培养单元；通过微加工技术在各层微流控芯片基材表面加工所需的微结构和微通道。
[0011]所述微流控芯片的芯片基材可以是PMMA、PC、PVC、C0C、铜、铝、不锈钢、硅片、玻璃圆片，也可是市售的各类普通⑶光盘。
[0012]所述微流控芯片的芯片和粘性薄膜的微结构和微通道可以通过数控铣刻、激光刻蚀、LIGA技术、模塑法、热压法、化学腐蚀制备，也可用软刻蚀技术制备。
[0013]—种微流控芯片的应用，该微流控芯片用于细胞水平药物联用，按照以下步骤进行:
[0014]从细胞培养室出口将细胞悬液加入细胞培养单元，使细胞在静压力驱动下流入细胞培养室；细胞贴壁后，入口连接蠕动栗加入不同的药物或细胞培养基，使药物生成浓度梯度后混合进入细胞培养单元，芯片置于细胞培养箱中；12?72小时后，可以将微流控芯片置于荧光显微镜下，进行药物对细胞响应参数的检测。
[0015]若入口连接蠕动栗加入洗涤溶液，洗涤液流入细胞培养室对细胞进行洗涤；
[0016]若入口连接蠕动栗加入标记溶液，标记溶液流入细胞培养室对细胞进行标记。
[0017]该微流控芯片以蠕动栗作为药物微流体流动的驱动力，不同入口可以使用不同的流速，灌注流速可以为0.5ul/min?20ul/min。
[0018]该微流控芯片可以在一块芯片上生成多种药物浓度梯度的不同水平混合，刺激多组细胞，可同时进行多药物多水平联用的筛选，提高了单位时间的平行筛选能力，适合大规模的高效的药物联用筛选。
[0019]该微流控芯片可以直观地研究多药物多水平联用对细胞的作用与影响。
[0020]该微流控芯片便于观察、设备简单、样品和试剂用量小，平行筛选能力高，有利于快速筛选新药的疗效和毒性，在细胞生物学、遗传学和药物筛选等相关领域具有广泛的应用前景。
[0021]所述的浓度梯度生成单元生成的药物溶液经混合单元的快速微通道、慢速微通道分别与对侧方向其他药物溶液的慢速微通道、快速微通道进行高低水平的混合，作用于下游细胞培养单元中的细胞。
[0022]本发明操作简单、实现了多种药物同时多水平联用，降低了试剂与样品的用量，高效地进行药物筛选，具有便携、经济、快速、高效的特点，在细胞生物学、遗传学和药物筛选等相关领域中具有良好的应用前景。
[0023]本发明具有如下优点:
[0024]本发明只需向四个入口分别加入含有药物的细胞培养基溶液就可以在细胞培养单元自动生成多种药物浓度梯度的多水平混合，自动分配到与之相连接的细胞培养室中。
[0025]本发明只需向入口中加入细胞悬液、洗涤溶液和标记溶液就可以完成细胞的接种、洗涤和标记操作。
[0026]本发明的创造性是在芯片上集成了多种药物的浓度梯度同时生成、混合，和芯片细胞培养、受激、洗涤、标记。
[0027]与传统的多孔板技术相比，本发明省去了配制和分配多种药物不同浓度溶液的繁冗操作，大大简化了细胞接种、受激、洗涤和标记操作过程，现住地降低了细胞和试剂的耗量。
[0028]本发明创造性滴将微流控芯片技术与药物联用方法相结合，利用芯片上各种功能单元灵活组合、规模集成的特征，同时产生大量筛选条件；利用高内涵筛选方法在一次试验中多细胞响应同时分析的特征，从而首次实现了微流控芯片细胞水平高通量、高内涵药物联用筛选。
【附图说明】
[0029]图1为微流控芯片的结构示意图，其中I为1#药物溶液或培养基入口，2为2#培养基或药物入口，3为3#培养基或药物入口，4为4#培养基或药物入口，5为1#浓度梯度生成单元，6为1#浓度梯度生成单元溶液出口，7为1#细胞培养单元出口，8为1#混合单元快速微通道，9为1#细胞培养室，10为1#混合单元慢速微通道，11为1#混合单元的药物溶液出口，12为2#混合单元的药物溶液出口，13为2#混合单元慢速微通道，14为2#细胞培养室，15为2#混合单元快速微通道，16为2#细胞培养单元出口，17为2#混合单元的药物溶液出口，18为2#浓度梯度生成单元
[0030]图2微流控芯片的实物图；
[0031]图3灌注染料后，细胞培养单元放大图。
【具体实施方式】
[0032]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制发明。
[0033]实施例1
[0034]—种微流控芯片，所述微流控芯片由2个浓度梯度生成单元5、18，I?10个混合单元和细胞培养单元构成，混合单元的入口为浓度梯度生成单元的药物溶液出口 6、17，浓度梯度生成单元的最上端为药物溶液或培养基入口 1、2、3、4 ;
[0035]所述的浓度梯度生成单元5为一个树状的、从上至下逐层增加分支的结构，每个分支的通道为迂回的折线形，最末端分支数量为混合单元数量的二分之一，且其每一个出口通过一个微通道与混合单元最上端相连，
[0036]所述的混合单元，为浓度梯度单元末端通道分支两个微通道，混合单元快速微通道8和混合单元慢速微通道10，混合单元快速微通道为长直通道，混合单元慢速微通道为长迂回的折线形通道，每个混合单元的长直通道与对侧的长迂回的折线形通道相连通，长迂回的折线形通道与长直通道的长度比例可以为I?10:1。
[0037]所述的细胞培养单元包括细胞培养室9，上端为混合单元的药物溶液出口 11，下端为细胞培养单元出口 7。
[0038]细胞水平药物联用的微流控芯片的制备
[0039]用计算机辅助设计软件设计和绘制微流控芯片的微结构和微通道图形，混合单元数量为5个，长迂回的折线形通道与长直通道的长度比例为4:1。利用SU8-3035光刻胶在75mm规格玻片上制作芯片的微结构和微通道模板，围片后，浇灌PDMS单体:引发剂(V: V)=12:1的PDMS，高度为2mm，真空除气泡，80°C I小时，取出放凉，切下PDMS芯片，使用打孔器将4个入口与10个出口打通，等离子封接在75mm玻片上，用乙醇擦拭芯片表面残留的指纹、油渍等污渍。紫外照射过夜灭菌后即可使用。如图2所示。
[0040]应用细胞水平药物联用的微流控芯片的表征利用实验室自行制作的细胞水平药物联用的微流控芯片，四个入口连接蠕动栗，1#药物溶液或培养基入口 1、4#药物溶液或培养基入口 4为水，2#药物溶液或培养基入口 2为红色染料，3#药物溶液或培养基入口 3为蓝色染料，设定四个入口流速均为6ul/min，开始注射，水与红色染料经浓度梯度生成单元5在浓度梯度生成单元各个出口 6处形成从无色、浅红至深红的溶液，其中浓度梯度生成单元出口 6处为无色溶液，经混合单元快速微通道8与混合单元慢速微通道10分流；浓度梯度生成单元出口 17处为深蓝溶液，经混合单元快速微通道15与混合单元慢速微通道13分流；混合单元快速微通道15与混合单元慢速微通道10连通混合进入细胞培养单元14，得到大量深蓝溶液与少量无色溶液的混合；混合单元慢速微通道13与混合单元快速微通道8连通混合进入细胞培养室9，得到大量无色溶液与少量深蓝溶液的混合。经稳定20分钟后，在各细胞培养单元可得到红与蓝不同水平的浓度混合，在不同细胞培养单元呈现深红-紫(红加蓝混合呈现)-深蓝的色域，如图3所示。
【主权项】
1.一种微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由2个浓度梯度生成单元，I?10个混合单元和细胞培养单元构成，混合单元的入口为浓度梯度生成单元的药物溶液出口，浓度梯度生成单元的最上端为药物溶液或培养基入口； 所述的浓度梯度生成单元为一个树状的、从上至下逐层增加分支的结构，每个分支的通道为迂回的折线形，最末端分支数量为混合单元数量的二分之一，且其每一个出口通过一个微通道与混合单元最上端相连； 所述的混合单元，为浓度梯度单元末端通道分支两个微通道，混合单元快速微通道和混合单元慢速微通道，混合单元快速微通道为长直通道，混合单元慢速微通道为长迂回的折线形通道，每个混合单元的长直通道与对侧的长迂回的折线形通道相连通，长迂回的折线形通道与长直通道的长度比例可以为I?10:1 ; 所述的细胞培养单元包括细胞培养室，上端为混合单元的药物溶液出口，下端为细胞培养单元出口。2.—种微流控芯片的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行:用计算机辅助设计软件设计和绘制微流控芯片中的微结构和微通道图形，包括浓度梯度生成单元、混合单元、细胞培养单元；通过微加工技术在各层微流控芯片基材表面加工所需的微结构和微通道。3.—种微流控芯片的应用，其特征在于该微流控芯片用于细胞水平药物联用，按照以下步骤进行: 从细胞培养室出口将细胞悬液加入细胞培养单元，使细胞在静压力驱动下流入细胞培养室；细胞贴壁后，入口连接蠕动栗加入不同的药物或细胞培养基，使药物生成浓度梯度后混合进入细胞培养单元，芯片置于细胞培养箱中；12?72小时后，可以将微流控芯片置于荧光显微镜下，进行药物对细胞响应参数的检测。4.根据权利要求3所述的一种微流控芯片的应用，其特征在于若入口连接蠕动栗加入洗涤溶液，洗涤液流入细胞培养室对细胞进行洗涤；若入口连接蠕动栗加入标记溶液，标记溶液流入细胞培养室对细胞进行标记。5.按权利要求3所述的一种微流控芯片的应用，其特征在于，该微流控芯片以蠕动栗作为药物微流体流动的驱动力，不同入口可以使用不同的流速，灌注流速可以为0.5ul/min ?20ul/mino6.按权利要求3所述的一种微流控芯片的应用，其特征在于，该微流控芯片可以在一块芯片上生成多种药物浓度梯度的不同水平混合，刺激多组细胞，可同时进行多药物多水平联用的筛选，提高了单位时间的平行筛选能力，适合大规模的高效的药物联用筛选。7.按权利要求3所述的一种微流控芯片的应用，其特征在于，该微流控芯片可以直观地研究多药物多水平联用对细胞的作用与影响。8.按权利要求3所述的一种微流控芯片的应用，其特征在于，该微流控芯片便于观察、设备简单、样品和试剂用量小，平行筛选能力高，有利于快速筛选新药的疗效和毒性，在细胞生物学、遗传学和药物筛选等相关领域具有广泛的应用前景。9.按权利要求3所述的一种微流控芯片的应用，其特征在于，所述的浓度梯度生成单元生成的药物溶液经混合单元的快速微通道、慢速微通道分别与对侧方向其他药物溶液的慢速微通道、快速微通道进行高低水平的混合，作用于下游细胞培养单元中的细胞。
【专利摘要】本发明提供一种微流控芯片及其制备方法和应用，所述微流控芯片由2个浓度梯度生成单元，1～10个混合单元和细胞培养单元构成，混合单元的入口为浓度梯度生成单元的药物溶液出口，浓度梯度生成单元的最上端为药物溶液或培养基入口。该微流控芯片集成有浓度梯度生成单元和混合单元，最终可生成多种药物不同水平的浓度混合刺激固定在特定的细胞培养单元的细胞，在显微镜下可以直观地研究细胞在生长过程中对多药物多水平联用的反应，为大规模的药物联用筛选提供了新思路和新研究技术，主要应用于细胞生物学、遗传学和药物筛选等相关领域，是一种可广泛用于各种细胞分析的新工具。
【IPC分类】C12M3/00
【公开号】CN105713834
【申请号】CN201410735524
【发明人】秦建华, 李中玉, 许慧
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所