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【专利说明】用于核酸纯化的一步程序
[0001]背景
核酸纯化通常由下述组成:从样品中释放核酸的裂解步骤，核酸与固体基质的结合，洗涤基质以去除污染物质，和在缓冲液中从基质洗脱核酸。该过程是复杂的，特别是在污染物去除的基质洗涤中。溶液必须加入基质中，其将去除污染物而不是核酸，并且随后这些溶液必须在从基质中洗脱核酸之前去除。如果磁性颗粒用作固体基质，则它们通常必须在结合步骤后进行捕获，通过从溶液中捕获和去除颗粒或通过固定颗粒和去除裂解结合溶液而与裂解结合溶液分开，并且随后释放到洗涤溶液内。在洗涤后，颗粒必须再次被捕获且与洗涤溶液分开。参见例如，Alderton，R.P.等人，Anal.B1chem.(1992) 201:166-169 和 WO91/00212。一些方案需要使用几种不同洗涤溶液的几个洗涤步骤。在颗粒已洗涤后，它们必须重悬浮于洗脱缓冲液中，以从颗粒中释放核酸。进一步地，这些程序通常对于核酸不是选择性的。相反，各种固体和溶解的物质同样凝集。
[0002]其他方案需要用例如乙醇使核酸沉淀。沉淀的核酸随后必须进行洗涤和重新溶解。也存在用于分离核酸的层析程序(参见例如EP O 658 164)，但这些程序也需要多个步骤和洗涤。
[0003]通过Boreal Genomics，Inc.(Los Altos, CA)的现有技术 SCODA (SynchronousCoefficient of Drag Alterat1n)系统使用脉冲电场将核酸集中到一个点，但这通常是可能非常稀释的预纯化材料。由在Northwestern University的Kelso(Sur等人，ImmisciblePhase Nucleic Acid Purificat1n Eliminates PCR Inhibitors with a Single Passof Paramagnetic Particle through a Hydrophobic Liquid， J.Mol.Diag.2012 12
(5):620-628)开发的油-门系统(oil-gate system)拉动颗粒通过油，以尝试消除洗涤，但该方法导致大量的盐遗留，因为油在颗粒周围留下大滴裂解溶液，这导致很多盐遗留。因此，当使用该系统时，需要另外的处理。
[0004]可见现有技术考虑的用于核酸分离/纯化的方法具有某些缺点。此类缺点涉及例如纯度、选择性、回收率、实验室安全和便利性、以及分离/纯化过程的速度。换言之，已知的现有技术程序需要多个步骤，且通常导致由于众多步骤的靶核酸丧失和/或靶核酸改变(例如由于重复的苛刻处理条件的修饰基团丧失)。
[0005]因此，待解决的问题是提供用于从样品中分离核酸的更简单程序，其节省时间和试剂，并且帮助阻止在处理期间的靶的丧失和/或靶的修饰。
[0006]发明概述
本发明涉及使用凝胶从洗脱缓冲液中分离裂解-结合溶液。颗粒用于捕获裂解-结合溶液中的核酸。颗粒是磁性的，并且使用磁场进行集中。具体地，颗粒通过磁场拉动穿过去除污染物的凝胶，并且将集中的颗粒重悬浮于洗脱缓冲液中。该过程非常简单。凝胶使裂解-结合溶液与洗脱缓冲液分开，并且限制或消除两者之间的混合。颗粒通过凝胶的移动去除污染物和盐。污染物通过经过凝胶而被去除(即它们被“刷(squeegeed)”掉)。盐通过经过凝胶被稀释。颗粒随后直接传递到在其中释放核酸的洗脱缓冲液中。磁性颗粒可以随后拉回到凝胶内，或者通过离心或沉降(重力)与洗脱缓冲液分开。这个过程已显示成功纯化来自血浆样品的HCV病毒RNA，使用实时PCR测定以检测丙型肝炎病毒(HCV病毒)RNA。
[0007]本发明考虑了从核酸样品中去除裂解缓冲液组分的方法，该方法包括:提供包含或怀疑包含核酸的样本，使样本与一种或多种裂解试剂接触，在适合于样本中的核酸与固体基材结合的条件下，使样本与固体基材接触一段时间，并且如果核酸存在于样本中，则使结合有核酸的所述固体基材经过水基分离凝胶(aqueous-based separat1n gel)。当裂解缓冲液含有浓度大于约I摩尔的盐时，本方法是有用的。固体基材可以是微粒，并且微粒可以为直径约0.1 nm至约5 nm或直径约0.8 nm至约5 nm。进一步地，微粒可以是磁性的。
[0008]本发明进一步考虑了在经过含水凝胶后，使与所述固体基材结合的核酸与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液从所述固体基材中洗脱核酸。再进一步地，核酸不在有机溶剂中沉淀，或核酸可以在有机溶剂中沉淀，并且有机溶剂可以是乙醇或任何其他合适的有机溶剂。
[0009]本发明进一步考虑了在经过含水凝胶后，在从固体基材洗脱前或后，使与固体基材结合的核酸与酶接触。酶可以是DNA聚合酶或逆转录酶。再进一步地，核酸可以在固体基材上进行测序，而无需稀释。
[0010]本发明进一步考虑了可以在经过含水凝胶后使与固体基材结合的核酸与重亚硫酸盐接触，使得将未甲基化的胞嘧啶脱氨基。本发明进一步考虑了核酸中的至少一个核碱基可以具有表观遗传修饰。
[0011]本发明再进一步考虑了核酸可以经由选自下述的实体与固体基材结合:核酸杂交、适体、抗体、抗体片段、生物素、抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。
[0012]本发明考虑了用于从样品中富集核酸的方法，该方法包括:提供怀疑包含核酸的样品、适合于结合核酸的微粒和水基分离凝胶，在适合于样品中的任何核酸与磁性微粒结合的条件下，使样品与微粒接触一段时间，以产生装载的磁性微粒；用磁场将装载的微粒拉动通过水基分离凝胶。凝胶可以是琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶可以为约0.10%至约1.0%的浓度。分离凝胶还可以包含乙醇和甘油中的一种或多种。颗粒还可以包含适合于结合核酸的官能团。
[0013]进一步考虑微粒可以是磁性的，并且磁性微粒任选至少部分涂布有二氧化硅和玻璃中的一种或多种。磁性微粒可以是球状体，尽管任何形状均被考虑为在本发明中是合适的。
[0014]进一步考虑样品可以包含裂解缓冲液。
[0015]附图描述
图1 (A - F)显示了如实施例中所述的本发明方法的例示。
[0016]图2显示了(A)如实施例2中详述的通过本发明的方法纯化的靶核苷酸序列的DNA扩增曲线和(B )内部对照。
[0017]图3显示了(A)如实施例2中详述的通过本发明的方法纯化的靶核苷酸序列的DNA扩增曲线和(B )内部对照。
[0018]发明详述
本方法涉及核酸的一步分离和纯化方法。该方法是简单的且容易由本领域普通技术人员执行。该方法涉及加入裂解溶液(裂解溶液是本领域普通技术人员已知的)和结合核酸的固体基材(例如氧化铁颗粒，磁性颗粒，至少部分地涂布有玻璃、二氧化硅等的磁性颗粒等)。存在的核酸将结合颗粒。在磁性颗粒的情况下，颗粒随后用置于测定容器外的磁源(即磁体)拉动通过含水凝胶(例如琼脂糖凝胶，尽管与核酸相容的任何凝胶例如SDS丙烯酰胺凝胶也将是合适的)。拉动颗粒通过凝胶的动作去除(即“刷去”)不溶性污染物，且稀释可溶性污染物(例如盐)。颗粒在离开凝胶后进入洗脱缓冲液。核酸在洗脱缓冲液中被释放。磁性颗粒随后可以被拉回到凝胶内，或允许沉降出来(或在从凝胶表面去除洗脱缓冲液中后离心出来)。该方法通常在管中执行，其中凝胶在裂解缓冲液上分层，并且洗脱缓冲液在凝胶上分层。任选地，非洗脱缓冲液可以在凝胶上分层，并且需要时，在以后的时间，从颗粒中洗脱核酸。洗脱缓冲液可以包含或不包含有机溶剂(例如乙醇)。
[0019]通常的裂解缓冲液包含盐。在裂解缓冲液中通常发现的盐包括但不限于硫氰酸胍(GITC)(通常范围为0.5 M至4.0 M)、NaCl (通常范围高达0.1 M至10.5 M)。裂解缓冲液还通常含有缓冲剂(例如Tris-HCl ;通常浓度为约25 mM，约pH 7至约pH 8，或本领域普通技术人员已知的其他合适缓冲剂)和去污