Hib综合培养基、b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及疫苗生产制备工艺技术领域，具体设及一种HIB综合培养基、B型流感 嗜血杆菌结合疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 流感嗜血杆菌化aemo地ilusInfluenzae,HI)是一种革兰氏阴性短小杆菌，是引 起小儿呼吸系统原发性感染和病毒性疾病时继发感染的重要致病菌。通常有芙膜型和非芙 膜型两大类。按其芙膜多糖抗原的特异性可分为a-f六个血清型和一组不可分型的流感嗜 血杆菌。其中b型流感嗜血杆菌的致病性最强，f次之，可引起多器官、组织的侵袭性感染。 从发达国家的流行病学资料可知，b型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎约占小儿化脈性脑膜炎 的一半左右，且具有发病率高、死亡率高和致死率高的特点。虽然临床上对b型流感嗜血杆 菌有多种抗生素可治疗，但由于细菌抗药性不断增加，b型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺 炎死亡率高，加之在抗生素治疗有效的情况下也不能阻止神经系统后遗症的发生，给临床 治疗带来了很大的困难。
[0003] b型流感嗜血杆菌的主要致病能力是其表面的芙膜，运个芙膜使细菌具有了抵抗 吞隧细胞和防止血清杀菌物质杀菌的能力。b型流感嗜血杆菌芙膜多糖（CP巧由若干个多 聚核糖基核糖醇一憐酸盐（PR巧组成。患b型流感嗜血杆菌感染性疾病后血清中可产生抗 特异性(PS抗体。从其血清流行病学可见，b型流感嗜血杆菌芙膜多糖（CP巧是b型流感 嗜血杆菌有效的保护性抗原，理想的疫苗应该是能刺激机体产生抗CPSIgG抗体，其抗体水 平> 0. 15ug/ml和> 1.Oug/ml，才能分别为婴儿提供短期和长期的免疫保护。
[0004] b型流感嗜血杆菌结合疫苗可有效地预防其疾病的发生，显著地降低b型流感嗜 血杆菌侵袭性疾病的发病率，保护婴幼儿的健康。目前，现有的b型流感嗜血杆菌结合疫苗 生产工艺，其关键步骤存在工艺复杂、成本较高，并且所制得的b型流感嗜血杆菌结合疫苗 不稳定，含有血源性成分且容易发生过敏反应，核酸、蛋白、内毒素含量高；同时，用于培养 b型流感嗜血杆菌的培养基均含有血源性成分和大分子过敏原性成分，从而影响疫苗生产 安全，另外，现有的用于培养b型流感嗜血杆菌的培养基的组成成分最少为12种，最多可达 至IJ14、15种，运无形之中增加了培养基成本，而且成分越多越复杂，可能给b型流感嗜血杆 菌结合疫苗带来不利影响。
[0005] 从已有的医院流行病学监测和人群流行病学报道结果看，虽然b型流感嗜血杆菌 引起脑膜炎的发病率较工业化国家低，但b型流感嗜血杆菌也是造成我国婴幼儿下呼吸道 急性感染的重要病原菌之一。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有用于培养b型流感嗜血杆菌的培养基存在的组分多、成本高、含有 血源性成分和大分子过敏原性成分W及现有b型流感嗜血杆菌结合疫苗生产工艺的关键 步骤存在工艺复杂、成本较高，并且所制得的b型流感嗜血杆菌结合疫苗不稳定，含有血源 性成分且容易发生过敏反应，核酸、蛋白、内毒素含量高的问题，本发明提供一种无血源性 成分和大分子过敏原性成分的HIB综合培养基、一种B型流感嗜血杆菌结合疫苗及其制备 方法。
[0007] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0008] 本发明的HIB综合培养基，该培养基中各成分及其终浓度为：
[0009] 酵母浸出粉5~15g/l，
[0010] 葡萄糖 5 ~15g/l，
[0011] MgClz? 6&0 1 ~3g/l，
[0012] P-辅酶A0. 01 ~0. 03g/l，
[0013] 氯化血红素 0. 005 ~0. 02g/l，
[0014] 胞2册〇4 ? 12&0 22 ~32g/l，
[0015] 胞帖〇4 ? 2&0 2 ~5g/l;
[0016] 该培养基不含有血源性成分和大分子过敏原性成分。
[0017] 优选的，该培养基中各成分及其终浓度为：
[001引酵母浸出粉lOg/1，
[001引葡萄糖lOg/1，
[0020] MgClz? 6&0 2. 03g/l，
[0021] P-辅酶A0. 02g/l，
[0022] 氯化血红素0.Olg/1，
[0023] 胞2册〇4 ? 12&0 28. 65g/l，
[0024] Na&PO* ? 2&0 3. 12g/l;
[0025] 该培养基不含有血源性成分和大分子过敏原性成分。
[0026] 本发明还提供了一种B型流感嗜血杆菌结合疫苗，它是利用上述的HIB综合培养 基制备而成的。
[0027] 本发明还提供了上述的B型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，该方法包括W下 步骤：
[0028] 步骤一、菌种接种与培养
[0029] 菌种采用编号为CCMC58534的b型流感嗜血杆菌，培养基采用HIB综合培养基， 该培养基中各成分及其终浓度为：酵母浸出粉5~15g/l，葡萄糖5~15g/l，MgClz? 6&0 1 ~3g/l，P-辅酶A0. 01 ~0. 03g/l，氯化血红素 0. 005 ~0. 02邑/1，胞2册〇4 *12&0 22 ~ 32g/l，NaH2P〇4 ? 2&0 2~5g^ ;该培养基不含有血源性成分和大分子过敏原性成分；
[0030] 步骤二、对步骤一所获得的培养液进行杀菌；
[0031] 步骤S、去核酸
[0032] 室溫条件下，将杀菌后的培养液离屯、收集上清液，按照上清液与十六烷基=甲基 漠化锭溶液的体积比为10:1的比例加入十六烷基=甲基漠化锭溶液，使上清液终浓度为 0. 1%，混匀后静置4小时W上，离屯、收集沉淀物并于沉淀物中加入Imol/L氯化钢溶液，将 沉淀物稀释至40~50mg/ml，补加与沉淀稀释物等体积的注射用水，再加入乙醇至其终浓 度为25%，于2~8°C静置4小时W上离屯、收集上清液；
[003引步骤四、沉淀多糖
[0034] 于收集的上清液中加入乙醇至其终浓度为75%，于2~8°C静置4小时W上离屯、 收集沉淀物，用无水乙醇和丙酬依次洗涂沉淀物并真空干燥，所得固体即为多糖粗制品；
[0035] 步骤五、多糖精制
[0036]将多糖粗制品溶解于1/10饱和醋酸钢溶液中，使多糖粗制品浓度为4~lOmg/ml， 混匀后加入等体积、抑为7. 0的冷酪溶液，离屯、收集上清液，酪提取法提取两次并合并上 清液，用Imol/L氯化钢溶液、膜超滤去除残留苯酪，再加入乙醇至其终浓度为75%，于2~ 8°C静置4小时W上，离屯、收集沉淀物，用无水乙醇和丙酬依次洗涂沉淀物并真空干燥，所 得固体即为精制多糖；
[0037] 步骤六、多糖的衍生
[003引将精制多糖用0. 85%氯化钢溶液溶解，精制多糖与0. 85%氯化钢溶液的比例为：lOmg: 1ml，再加入漠化氯溶液对精制多糖进行活化，精制多糖与漠化氯的比例为：2mg:Img， 反应3~10分钟后调节抑至8. 5,向反应液中加入等体积、浓度为0. 25mol/L、经过0. 85% 氯化钢溶液溶解的己二酷阱溶液，反应25~35分钟，于2~8°C揽拌过夜；反应液用0. 85% 氯化钢溶液、膜超滤去除残留漠化氯和己二酷阱，浓缩至多糖含量24mg/mlW上，获得多 糖衍生物；
[00測步骤屯、载体蛋白
[0040] 载体蛋白采用破伤风类毒素，对破伤风类毒素原液进行纯化，收集分子量为150kD 的洗脱液，再采用截留分子量为lOkD的超滤膜将纯化的破伤风类毒素超滤浓缩至24mg/ml W上，除菌过滤并分装；
[0041] 步骤八、多糖衍生物与载体蛋白的结合
[0042] 将多糖衍生物与纯化的破伤风类毒素等质量混合，调节pH至5. 5~5. 8,加入经过 0. 85%氯化钢溶液溶解的碳二亚胺溶液，使终浓度为0. 05mol/l，并且使多糖衍生物和破伤 风类毒素的终浓度均为lOmg/ml，维持抑5. 6反应4小时；用截留分子量为10KD的膜包超 滤，获得多糖蛋白结合物；
[0043] 步骤九、多糖蛋白结合物纯化
[0044] 对超滤后的多糖蛋白结合物进行纯化，收集洗脱液，除菌过滤后获得