4-[6-乙基-4-(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-O-β-D-吡喃葡萄糖基丁酸及其药物组合物和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于药物技术领域。具体地，涉及一个新的4-(lH)-吡啶酮葡萄糖苷类化 合物，以其为活性成分的治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其制备方法，及其在制药中的 应用，特别是在制备抗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（h印atitisBvirus，HBV)引起呈慢性携带状 态的传染病。慢性乙型病毒性肝炎（chronichepatitisB，CHB)是引发肝硬化、肝癌的主要 病因之一。据世界卫生组织（WHO)统计，全世界共有20亿HBV携带者，其中CHB患者约3. 5 亿；中国HBV携带约1. 2亿人，CHB患者超过3000万（林永焕.乙型肝炎预防与治疗[M]. 北京：科学技术文献出版社，2007.;LavanchyD.JViralH印atitis. 2004, 11，97-107.)。 现有的抗HBV药物（主要包括疫苗、干扰素和核苷类）的疗效已得到确认，其中疫苗以预防 为主，对已感染者无效；干扰素和核苷类药物因副作用明显、易产生耐药性、作用靶点单一 等原因远不能满足临床需要（AntonioC?，等?JHepatol. 2006, 44, 77-83;LvZ.L?，等?J MedChem. 2010, 53, 660-668.;吴剑涓.天津药学.2006,18,49-52.)。目前乙型肝炎依旧 是威胁全世界人类健康的重要问题，结构和作用机制新颖的抗HBV药物仍然是全球药物研 发的热点。
[0003] 天然产物结构复杂多样，从中寻找高效低毒、作用靶点新颖的先导化合物已经 成为新型抗KW药物研发的重要组成部分。茵陈为菊科植物滨蒿Artemisiascoparia Waldst.etKit?或茵陈蒿ArtemisiacapillarisThunb?的干燥地上部分。中医认为 其气芳香，有清湿热，退黄疸的功效，临床上主要用来治疗黄疸尿少、湿疮瘙痒、黄疸型传 染性肝炎等症状。《中国药典》中收录的多种治疗乙肝的中药制剂（乙肝宁颗粒、乙肝养 阴活血颗粒、小儿肝炎颗粒、护肝片、利肝隆颗粒、肝炎康复丸、茵芪肝复颗粒、茵栀黄口服 液、茵胆平肝胶囊、黄疸肝炎丸、清肝利胆胶囊等）中均以茵陈作为主要药效组分（中国 药典，2010版）。研究表明茵陈中主要含有香豆素，烯炔，黄酮，三萜，留体，长链脂肪族化 合物，及挥发油等（Wu，T.S?，等.BioorgMedChem.2001，9,77_83;0kuno，I?，等.Chem PharmBull. 1988,36,769-775)。然而，现有文献中对于这些化合物活性的报导主要集 中在保肝利胆方面，其抗HBV活性研究较少，仅见2014年赵勇等从茵陈蒿中分离得到系 列倍半萜、绿原酸衍生物、三萜、黄酮、木质素和酚酸类成分具有一定的体外抗HBV活性 (ZhaoY?，等?Fitoterapia. 2014,95, 187-193.;ZhaoY?，等?J.Ethnopharmacol. 2014， 156,147-154.)〇
[0004] 迄今，现有技术中无化合物4-[6_乙基-4_(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-〇_f3 -D-吡 喃葡萄糖基丁酸（1)的报道，也没有其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有该化合 物及其药物组合物在制备治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用的报道。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的化合物4_[6_乙基-4-(lH)_吡 啶酮-2-基]-3R-0-P-D-吡喃葡萄糖基丁酸（1)，含有治疗乙型病毒性肝炎有效量的化合 物1及药用载体或赋形剂的药物组合物，化合物1及其药物组合物的制备方法，化合物1或 其药物组合物在制备抗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0007] 结构式⑴所示的化合物4-[6_乙基-4-(lH)-吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃 葡萄糖基丁酸（1)，
[0008]
[0009] 药物组合物，其中含有治疗有效量的式（I)化合物1和药学上可接受的载体。
[0010] 用于治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其中含有治疗有效量的式（I)化合物1 和药学上可接受的载体。
[0011] 如所述的药物组合物，为治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物。
[0012] 所述的式（I)化合物1在制备治疗人类疾病或病症的药物中的应用。
[0013] 如所述的应用，其中所述的疾病是乙型病毒性肝炎。
[0014] 所述药物组合物在制备治疗人类疾病或病症的药物中的应用。
[0015] 如所述的应用，其中所述的疾病是乙型病毒性肝炎。
[0016] 制备权利要求1所述式（I)化合物1的方法，取茵陈蒿（Artemisiacapillaris) 或滨蒿（Artemisiascoparia)干燥全草，粉碎，用90%乙醇回流提取两次，每次3小时，合 并乙醇提液，减压回收乙醇得浸膏，浸膏用80%乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶 剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用9:1:0、9:1:0. 1、8:2:0. 2、6:4:0. 4的氯仿-甲醇-水梯 度洗脱，得到5个组分A-E，组分D经过MCICHP-20Pgel柱中压制备，20:80至80:20的 乙腈-水梯度洗脱，得到5个流份D-1~D-5。D-4经硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇-水 8:2:0. 2洗脱，得到两个流分D-4-1和D-4-2,D-4-1经Rp-Cls柱中压制备，乙腈-水20:80 洗脱，纯化得到化合物1。
[0017] 制备含4_[6_乙基-4-(lH)_吡啶酮-2-基]-3R-〇_f3 -D-吡喃葡萄糖基丁酸（1) 的药物组合物的方法是以化合物4- [6-乙基-4- (1H)-吡啶酮-2-基]-3R-0- 0 -D-吡喃葡 萄糖基丁酸（1)为原料，加入可药用载体或赋形剂。
[0018] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物 组合物含有0. 1~99 %，优选为0. 5~90 %的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对 人和动物无毒和惰性的药物制剂常用的药用载体和/或赋形剂。将本发明的药物组合物以 单位体重服用量的形式使用。
【附图说明】：
[0019] 图1为4-[6_乙基-4-(lH)_吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃葡萄糖基丁酸（1) 的2DNMR相关和ECD谱；
[0020] 图2为化合物4-[6_乙基-4_(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃葡萄糖基丁 酸（1)的结构式。
【具体实施方式】：
[0021] 为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进 一步说明本发明化合物4-[6-乙基-4-(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-0-0 -D-吡喃葡萄糖基丁 酸（1)的药理作用结果，以及本发明的制备方法及药物组成，但并不以此试验例和实施例 来限定本发明的实质性内容。
[0022] 试验例1 :
[0023] 4-[6_乙基-4-(lH)_吡啶酮-2-基]-3R-〇-f3 -D-吡喃葡萄糖基丁酸⑴对乙肝 病毒表面抗原（HBsAg)和乙肝病毒e抗原（HBeAg)的分泌以及乙肝病毒DNA(HBVDNA)复 制的抑制作用以及对ffepG2. 2. 15细胞的细胞毒性。
[0024] 1材料和方法
[0025] 1. 1材料：4-[6_乙基-4_(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-0-P-D-吡喃葡萄糖基丁 酸（1);泰诺福韦（江西晨阳药业有限公司）；HepG2.2. 15细胞（广州空军医院）；高糖 DMEM(GIBCO) ;G418(GIBIC0);胎牛血清（GIBICO) ;L-谷氨酰胺（AMRESC0);青霉素，链霉 素[石药集团中诺药业（石家庄）有限公司]。
[0026] 1. 2 仪器：酶标仪Bio-RAD68〇 (美国）；C02培养箱ThermoForma3：310 (美国）； 倒置生物显微镜XD-101型（南京）；荧光定量PCR仪Mastercycler印realplex型（德 国eppendorf公司）；低温高速离心机Centrifuge541f5D型（德国eppendorf公司）。
[0027] 1. 3实验过程：HepG2. 2. 15细胞生长培养基组成为高糖DMEM，10%的胎牛血清， 0. 03%L-谷氨酰胺，100mg/LG418, 100IU青霉素以及100IU链霉素。维持液组成为高糖 DMEM，2%的胎牛血清，0. 03%L-谷氨酰胺，100mg/LG418，100IU青霉素以及100IU链霉 素。供试药物由维持液稀释配制成一定浓度的含药培养基。将胰酶消化后的单细胞悬液接 种于细胞板上，于48h后换为含药培养基，每种药物用维持液四倍稀释为四个药物浓度，同 时设置只加维持液的细胞对照组，并以泰诺福韦做阳性药物对照。用MTT法测定药物对细 胞的毒性；用酶联免疫法测定HBsAg和HBeAg载量，用荧光定量PCR法检测HBVDNA载量。
[0028] 1. 3. 1药物细胞毒性测定：
[0029] 根据Mosmann建立的MTT法检测药物的细胞毒性。具体方法是：IfepG2. 2. 15细 胞接种于48孔板，3X104细胞每孔，加入生长培养基，于5%C02, 37°C培养箱中培养72h，吸 除原培养基，加入不同浓度含药培养基，于5%C02, 37°C培养箱中继续培养72h后吸除培养 基，按0. 2mL每孔加入浓度为0. 8mg/mL的MTT，于37°C5%C0J?育4h后弃上清，每孔中加 入0. 2mL二甲基亚砜，于37°C孵育10min，至生成的蓝紫色结晶物完全溶解，在酶标仪上测 定溶液在490nm下的吸光度值。根据结果计算药物对细胞的破坏百分率：
[0030] n destroy = (A细胞对醒-A供试样品组)/细胞对醒-A空白组)X100%。
[0031] 1. 3. 2抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的测定：
[0032] 利用ELISA(酶联免疫吸附试验）法，测定样品对HBsAg和HBeAg抑制活性。IfepG 2. 2. 15细胞接种于48孔板，3X104细胞每孔，加入生长培养基，于5%C02,37°C培养箱中培 养72h，吸除原培养基，加入不同浓度含药培养基，于5%C02,37°C培养箱中培养72h。取上 清液，分别利用HBsAg和HBeAg试剂盒检测。利用酶标仪测定溶液在的吸光度值（490nm)。
[0033] 抑制率Hinhibitory= (A细胞对照组-A供试样品组）/ (A细胞对照组-A空白组）X100%
[0034] 1(：5。=411衍18[(50-〈50%抑制率）八>50%抑制率-〈50%抑制率）\18(稀释 倍数）+lg(〈50 %抑制率的浓度）]
[0035] SI=CC50/IC50
[0036] 1. 3. 3抑制HBVDNA复制活性的测定：
[0037] 具体方法是：IfepG2. 2. 15细胞按5X105个每孔接种于24孔细胞板，于 5%C02,37°C培养箱中用生长培养基培养，72h后更换为含药培养基，48h后继续以含 药培养基更换原培养基，培养48h。使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANampGemomicDNAKit，TIANGEN，China)提取细胞DNA。用HBV核酸定量检测试剂盒 (QIAGEN,Co.，Ltd,Shenzhen)荧光定量PCR法定量检测HBVDNA载量。取2yLDNA样品， 加入 37.6yLHBVPCR反应液，0.4yLTaq酶，0.06yLU